2.2.2.5 나이아신

가. 쾨니히(König, 케니히)반응에 의한 비색법

1) 분석원리

식품중에 존재하는 나이아신아미드를 산 또는 알칼리로 가수분해하여 얻은 나이아신에 브롬시안을 가한 후 방향족 아민(aniline, metol. β-Naphthalin, ρ-aminoacetophenone 등)을 반응시켜 얻어지는 황적색의 색소를 비색정량 하는 방법이다.

2) 시약 및 시액

가) 포화황산아연용액：황산아연(ZnSO4․7H2O) 800 g을 물에 녹여서 1 L로 한다.

나) 브롬시안용액：브롬시안(cynogen bromide, BrCN, 특급 이상)을 물에 녹여 10%로 한다.

다) 나이아신 표준용액：나이아신 표준품 약 100 mg을 정밀히 달아 100 mL 메스플라스크에 넣고 10 N 황산액 1 mL를 가하여 녹인 후 물로 100 mL되게 한다. 이것을 원액으로 해서 차광하여 냉장고에 보존한다. 사용 시 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 및 2.5 mL를 각각 취해 물을 가하여 100 mL로 희석한다.

라) 파라아미노 아세토페논(para-amino acetophenone) 용액：파라아미노 아세토페논 2 g을소량의 염산에 녹여서 물을 가하여 100 mL로 한다.

3) 시험용액의 조제

가) 가수분해

100 mL의 비커에 나이아신 400 μg 상당량의 검체를 취한다. 6 N 염산액 20 mL를 가해비등수욕 중에 60분간 침출하여 가수분해 한다. 이것을 흐르는 물로 냉각시켜 100 mL 메스플라스크에 옮겨 넣고 물로 100 mL로 하여 여과 또는 원심 분리하여 여액 또는 상등액을 검체용액으로 한다.

나) 중화

검체 용액 25 mL를 원심 침전관에 취하고 페놀프탈레인시액 2방울을 가해서 6 N 수산화나트륨액 20 mL로 미산성이 될 때까지 중화한다.

다) 탈색

이 중화액에 포화 황산아연용액 2 mL를 가해 소포제로서 아밀알콜 수 방울을 가하고 다음에 수산화아연의 침전이 생길 때까지 잘 진탕 혼합하여 3 M 수산화나트륨액과 1 N 수산화나트륨액을 가하여 중화한다. 다음에 pH 6.5가 될 때까지 2 N 황산액을 가하고 다시 물을 가하여 50 mL로 한다. 때때로 진탕 혼합하여 10분간 방치한 후 원심분리 또는 여과하여 이것을 시험용액으로 한다.

4) 시험방법

가) 기기 측정조건

(1) 발색

시험용액 5 mL씩을 2개의 시험관에 취하고 여기에 브롬시안용액 2 mL씩을 가하여60～70℃의 수욕 중에서 10～15분간 반응시킨다. 얼음물 중에서 냉각시키면서 한쪽에파라아미노 아세토페논(para-amino acetophenone) 용액 1 mL를 가하여 다른 쪽을 대조액으로 하여 2개의 시험관에 물로 10 mL로 한다.

(2) 비색：(1)에서의 발색액은 얼음물 중에 냉각한 대로 암실에 10～15분간 방치한 후 대조액에 대하여 파장 420 nm에서 흡광도 A를 측정한다.

나) 검량선 작성：각 농도의 나이아신 표준액의 1 mL를 취해 물 4 mL를 가해서 이하 정량시험방법 (1), (2)에 따라서 검량선을 작성한다.

5) 계산

시험용액 5 mL중에 함유한 나이아신량을 검량선에 나타난 A에 대응하는 점으로부터 구하여 X(μg)로 한다.

(총나이아신 함량=나이아신함량+나이아신아미드함량)

검체중의 총 나이아신(mg/100 g)＝ X×40×	100	×	1
	검체채취량(g)		1,000

나. 미생물학적 시험법

1) 시약 및 시액

가) 나이아신보존용액

미리 건조하여 데시케이터 중에서 건조한 나이아신 표준품을 에탄올에 용해하고 그 1 mL가나이아신 100 μg을 함유하게 한다. 이 용액은 냉소에 보존한다.

나) 나이아신 표준용액

나이아신 보존용액을 물로 희석하여 그 1 mL가 나이아신 0.1 μg을 함유하도록 한다. 사용할 때 조제한다.

다) 카제인 산분해 용액

배지작성에 대하여 각 비타민, 무기염류, 카제인 산분해물 등은 적당한 농도의 예제액을만들어 냉장고 중에 보존하여 두면 편리하다. 이 보존액에 잡균이 혼합되지 않게 하고, 보존액에서 배지를 작성함에 있어 각 비타민의 보존액에 다른 비타민이 혼입되지 않게 특히 주의한다. 배지를 만들 때에는 일반적으로 각 성분을 혼합, 용해한 다음에 10% 염산용액 또는 수산화나트륨용액을 사용하여 pH 3.5로 조정하고, 약 20분간 비등수욕상에서 가온하고, 냉각 후 여과하여 물을 가해서 배양시의 2배 농도의 배지를 작성한다. 다음에 공통성분의 염류용액과 카제인산분해액의 제법을 참고한다.

라) 아데닌, 구아닌, 우라실 용액

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1 g을 20% 염산용액 5 mL에 가열하면서 용해하고 냉각 후 물을 가하여 100 mL로 하고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

마) 시스틴, 트립토판용액

L-시스틴 2 g 및 L-트립토판 0.5 g(또는 DL-트립토판 1 g)을 물 350～400 mL에 현탁하고 70～80℃에 가열하고 고형물이 용해할 때까지 20% 염산용액을 적하한다. 냉각 후 물을 가하여 전량을 500 mL로 하고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

바) 비타민B1, 비타민B2, 비오틴용액

비타민B1염산염, 비타민B2및 비오틴을 0.02 N 초산에 녹이고, 그 1 mL가 비타민B1염산염 10 μg, 비타민B220 μg 및 비오틴 0.04 μg을 함유하게 한다. 이 용액은 톨루엔 소량을 가하여 광을 피해서 냉소에 보존한다.

사) 파라아미노안식향산, 판토텐산칼슘, 비타민B6용액 1 mL가 파라아미노 안식향산 10 μg, 판토텐산칼슘 20 μg 및 피리독신 염산염 40 μg을 함유하게 25% 에탄올에 녹인다.

아) 염류용액 A 및 염류용액 B

(1) 염류용액 A

제일인산칼륨(KH2PO4) 및 제이인산칼륨(K2HPO4) 각 5 g을 물에 용해하여 전량을 100 mL로 하고 염산 1방울 및 톨루엔 소량을 가하여 보존한다.

(2) 염류용액 B

황산마그네슘(MgSO4․7H2O) 2 g, 염화나트륨(NaCl) 0.1 g, 황산제1철(FeSO4․7H2O) 0.1 g 및 황산망간(MnSO4․4H2O) 0.1 g을 물에 용해하여 전량을 100 mL로 하고 염산 1방울 및 톨루엔 소량을 가하여 보존한다.

자) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10 mL, 시스틴, 트립토판용액 10 mL, 아데닌, 구아닌, 우라실용액 2 mL, 비타민B1, 비타민B2, 비오틴용액 2 mL, P-아미노 안식향산, 판토텐산칼슘, 비타민B6용액 2 mL, 염류용액 A 2 mL및 염류용액 B 2 mL를 혼합하고 여기에 포도당 4 g 및 무수초산나트륨 2 g을 가하여 용해하고, 10% 수산화나트륨용액으로 pH를 6～8로 조정한다. 다음 물을 가하여 전량을 100 mL로 한다. 필요하면 여과한다(또는 Niacin Assay Medium, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

차) 접종용액의 조제

Lactobacillus plantarum의 보존균주

물 100 mL에 효모엑기스 2 g을 녹이고 여기에 포도당 0.5 g, 무수초산나트륨 0.5 g을 가하여 pH 6.8로 조정한 다음, 수욕상에서 10～20분간 가열하고, 여과후 한천 1.5 g을 가하고 한천이 용해될 때까지 수욕상에서 흔들어 혼화하면서 가열한다. 가열시 이 용액 약 10 mL씩을 시험관에 분주하고, 솜마개를 하고, 1 kg/cm2에서 10분간 가압 멸균하고 시험관을 수직의 위치에 보존하여 냉각한다.Lactobacillus PlantarumATCC, No8014의 보존균주로부터 멸균한 배지 10 mL에 접종하고 37℃에서 16～24시간 배양하고, 냉소에 보존한다. 보존균주는 매주 새로 조제한다. 1주 지난 것은 사용하여서는 아니된다(또는 Lactobacilli agar, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

카) 배지

기초 배지 5 mL를 함유하는 시험관에 나이아신 1 μg을 함유하게 하고 물을 가하여 솜마개를 하고 1 kg/cm2에서 10분간 가압 멸균하여 방냉한다(또는 Lactobacilli broth AOAC, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

타) 접종균액

Lactobacillus plantarum의 보존균주를 멸균한 배지 10 mL에 접종하고 37℃에서 16～24시간 배양한다. 여기에서 얻은 배양액을 잘 진탕 혼합한 다음 그대로 접종균액으로 하여 사용한다.

2) 시험용액의 조제

검체 일정량을 적당한 크기의 플라스크에 취하고 다음의 어느 방법에 따라서 시험용액을 조제한다.

가) 염기성 물질 함량이 적은 고체 또는 반고체검체

검체의 적어도 10배량의 1 N 황산을 가하여 잘 혼합한다. 이 용액 1 mL는 나이아신 5 mg이상을 함유하여서는 아니된다. 다음에 1 N 황산으로 플라스크의 벽에 부착한 검체를 세척하여 떨어뜨린 다음 1 kg/cm2에서 30분간 가압 추출하고, 냉각 후 1 N 수산화나트륨액을 가하여 pH 6.5로 조정하고, 다음에 물을 가하여 용액 1 mL가 나이아신 약 0.1 μg을 함유하게 희석하고, 필요하면 여과한다.

나) 염기성물질 함량이 많은 고체 또는 반고체검체

검체에 소량의 물을 가하여 잘 혼합하고, 여기에 1 N 황산을 가하여 pH를 약 6으로 하고, 다음에 검체의 적어도 10배량의 1N 황산을 가하여 혼합하고 이하 가)에 따라서 조제한다.

다) 액체검체

검체에 1 N 황산 또는 1 N 수산화나트륨액을 가하여 pH를 약 6으로 조정하고 이하 나)에 준하여 조제한다.

3) 시험방법

가) 산도적정법에 의한 정량법

나이아신 표준용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 2개씩에 나이아신 표준용액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75 및 2 mL를 취하고 각 시험관에 기초 배지 5 mL 및 물을 가하여 전량을 10 mL로 한다. 따로 시험용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 3개씩에 시험용액 0.3, 0.6 및 0.9 mL를 가하고 다음에 각 시험관에 기초 배지 5 mL 및 물을 가하여 전량을 10 mL로 한다. 양 계열의 시험관의 내용물은 잘 흔들어 혼합하고 솜마개를 하든가 또는 뚜껑을 한 다음 1 kg/cm2에서 10분간 가압 멸균하고, 냉각 후 각 시험관에 접종액 7 μL씩을 무균적으로 접종하고 37℃에서 72시간 배양기에 넣어서 배양한다.배양 후 각 시험관 중에 생긴 산을 0.1 N 수산화나트륨액으로 적정한다(지시약：0.1% 페놀프탈레인시액).

나이아신 표준계열의 각 단계에 따른 측정치의 평균치를 각 시험관에 가한 나이아신의 μg수에 대한 검량선을 작성한다. 다음에 이 검량선을 사용하여 내삽법에 따라서 검체 계열의 각 관중의 나이아신 함량을 구한다. 이 때의 측정치가 0.15 μg 이상 및 0.025 μg이하의 것이 있으면 제외하고 남은 각 시험관에 대해서 시험용액 1 mL에 대한 나이아신의 함량을 구한다. 6개 이상의 관으로부터 얻어진 각각의 치가 그의 평균치보다 ±10%를 초과하는 것이 없는 것을 확인한 다음에 다시 이것만의 평균치를 구하고, 다음에 검체중의 나이아신 함량을 산출한다.

나) 탁도 측정에 의한 정량법

탁도 측정에 의한 정량법은 산도측정에 비하여 정밀도는 약간 낮지만 결과를 신속히 알게되는 이점이 있다. 나이아신의 검량선을 0～0.1 μg/4 mL로 하고, 시험용액 계열의 나이아신 함량도 거기에 따라서 감해지면 좋다. 그러나 균의 배양시간은 20～40시간으로 한다. 탁도는 570～650 nm에서 흡광도를 측정한다.

다. 액체크로마토그래프에 의한 정량

1) 분석원리

식품중에 포함되어 있는 나이아신을 수용액으로 추출, 정제한 후 고속액체크로마토그래프를이용하여 정성 및 정량분석하는 방법이다.

2) 장치

고속액체크로마토그래프 : 자외부검출기를 사용한다.

3) 시약 및 시액

가) 5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 초산 1 mL을 1 L 용량플라스크에 넣은후 증류수로 약 900 mL까지 채우고, sodium hexanesulfonate (FW=182.22)를 5 mM 농도가 되도록 넣고 증류수로 1 L를 맞춘다.

나) 용매 : 메탄올, n-헥산 등은 HPLC 급 또는 이와 동등한 것

다) 물 : 3차증류수 또는 이와 동등한 것

라) HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance) 카트리지 : N-vinylpyrrolidine과 divinylbenzene이copolymer의 형태로 결합된 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 3mL) 또는 이와 동등한 것

마) 표준원액 : 나이아신 및 나이아신아미드를 각각 증류수에 녹여 100 mg/L로 한다.

바) 표준용액 : 표준원액을 각각 증류수에 녹여 적당한 농도로 희석, 혼합한다.

4) 시험용액의 조제

가) 추출

검체 일정량(1-10 g)을 정밀히 달아 100 mL 메스플라스크에 넣고 5 mM sodium hexanesulfonate /0.1% 초산 용액에 녹여 100 mL가 되도록 한다.

이 용액을 30분간 초음파 추출한 후 추출액을 원심분리기를 사용하여 0℃, 9000 rpm에서 30분간 원심분리한다. 상등액을 취해 membrane syringe filter(pore size 0.2 ㎛, 25 mm)로 여과한다.

정제가 필요한 경우에는 100% 초산을 이용하여 pH 4.1 ~ 4.5가 되도록 조정하여 정용하고 원심분리, 필터 여과를 실시한 후 아래와 같이 HLB카트리지를 이용하여 정제과정을 추가로 실시한다.

나) 정제

HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance) 카트리지를 준비하고 카트리지에 5 mL의 메탄올과 5 mL의 증류수를 연속으로 통과시킨 후 카트리지에 여과액 10 mL를 통과시켜 나이아신 및 나이아신아미드가 카트리지에 흡착되도록 한다. 카트리지는 5 mL의 n-헥산으로 세척한 후 80% 메탄올용액 5 mL로 용출한다.

용출액은 10 mL 메스플라스크에 모으고 증류수를 가하여 10 mL로 하여 시험용액으로한다.

5) 시험방법

가) 크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : Capcellpak UG120V(4.6×250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 및 유속 : 1 mL/min

A: 5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% acetic acid

B: 5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% acetic acid : MeOH(35:65)

A:B=100:0(3min hold) → 3%/min → A:B=70:30(7 min hold)

(3) 주입량 : 10 μL

(4) 검출기 및 파장 : 자외부(UV) 검출기(260 nm)

(5) 칼럼오븐온도 : 40℃

나) 검량선 작성

나이아신 및 나이아신아미드 표준용액을 희석하여 일정농도가 되도록 제조한 후 HPLC에 10 μL씩 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상 각 피크의 넓이를 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품 및 검체의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준물질 및 검체의 크로마토그램

그림 2. 액체크로마토그래프 PDA 스펙트럼

라) 회수율 및 정량(검출)한계

표 1. 영유아식 중 나이아신의 회수율 및 RSD(%)

분석성분	처리농도(mg/kg)	회수율 (%)				RSD(%)
		검체-1	검체-2	검체-3	평균
나이아신	100	82.5	83.5	88.1	84.7	3.5
나이아신아미드	100	103.1	104.2	106.2	104.5	1.5
나이아신	10	82.5	81.5	85.4	83.1	2.4
나이아신아미드	10	103.4	102.4	99.1	101.6	2.2

표 2. 나이아신의 검출한계 및 정량한계

분석성분	검출한계(mg/kg)	정량한계(mg/kg)
나이아신	0.2	1.0
나이아신아미드	0.2	1.0

6) 정성시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하여 얻어진 피크의 머무름 시간(retention time)을 비교해서 나이아신의 성분을 확인한다.

7) 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 피크의 면적 또는 높이를 측정하여 작성한 검량선으로부터 나이아신의 함량을 정량한다.(총나이아신함량 = 나이아신함량 + 나이아신아미드함량)

가) 계산방법

(1) 영아용 조제식 및 성장기용 조제식, 조제유류

나이아신(μg/100 kcal)	=	시험용액의 농도(μg/mL)	×	시험용액의 부피(mL)	×	100
				시료량(g)		1g당 kcal

(2) 특수의료용도식품

나이아신(mg)*	=	시험용액의 농도(μg/mL)	×	시험용액의 부피(mL)	×	1	×	1회섭취량(mg)
				시료량(mg)		1000

* 특수의료용도식품의 단위는 표시사항에 따라 변동될 수 있음.