2.2.2.6 비타민E

가. 고속액체크로마토그래프에 의한 정량(제1법)

1) 장치

액체크로마토그래프 : 형광검출기를 사용한다.

2) 시약 및 시액

가) 에탄올：에탄올(특급) 1 L에 50% 수산화나트륨용액 5 mL 및 아연분말 5 g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다.

나) 헥산：스펙트로분석용

다) 무수황산나트륨：무수황산나트륨(시약특급)을 120℃에서 2시간이상 가열시킨 후 데시케이터(실리카겔)에서 방냉하고 마개를 꼭 막아 보존한다.

라) α-, β-, γ-, δ-토코페롤：d-α-, d-β-, d-γ-, d-δ-토코페롤 순품

마) 표준용액의 조제

(1) 토코페롤동족체 표준용액

토코페롤 동족체(α-, β-, γ-, δ-토코페롤)을 각각 100 mg씩 정밀히 달아 헥산을 가해녹여 100 mL로 한 후, 각각의 5 mL를 취하여 헥산을 가하여 25.0 mL로 한다.

공전 갈색유리병에 넣어 공기를 질소가스로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보존한다(1개월간 사용할 수 있다).

(2) 토콜(tocol)표준용액

토콜(tocol) 약 100 mg을 정밀히 달아 헥산을 가해 녹인 후 100 mL로 한다. 이 5 mL를 취해 헥산을 가해 25.0 mL로 한다. 공전 갈색유리병에 넣어 공기를 질소가스로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보존한다(1개월간 사용할 수 있다).

3) 시험용액의 조제

가) 일반식품 및 축산물의 경우(버터 등 유지류를 제외한다)

토코페롤로서 약 0.2 mg을 함유하는 검체를 갈색 둥근바닥플라스크에 정밀히 달아(Wg) 에탄올 30 mL 및 10% 피로갈롤․에탄올 용액 1 mL를 가하고 이에 수산화칼륨용액(9→10) 3 mL를 가해 환류냉각기를 부착하고 95℃ 수욕에서 플라스크를 2/3 잠기게 하여 30분간 비누화한다. 비누화후 즉시 냉각하여 실온으로 한 후 물 30 mL를 가해 갈색 분액깔때기에 옮긴다. 플라스크는 물 10 mL, 석유에테르 30 mL로 씻어 넣고 잘 흔들어 혼합하여 방치한 후 석유에테르층을 분취한다. 물층은 석유에테르 30 mL씩으로 2회 추출하고 석유에테르액을 합하여 물 10 mL로 1회, 이어 물 50 mL로 페놀프탈레인 시액이 분홍색이 되지 않을 때까지 씻는다. 분액깔때기중에서 물을 충분히 분리한 석유에테르층을 무수황산나트륨에 통과시켜 탈수한 후 갈색플라스크에 옮긴다. 잔존하는 황산나트륨은 다시 석유에테르 10 mL씩으로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 모두 합한 다음 전석유에테르추출액을 40～45℃에서 감압증발건조한 후 잔류물은 헥산 1.0 mL를 가하여 녹여 이를 시험용액으로 한다.

나) 버터등 유지류의 경우

검체가 유지인 경우에는 위의 조작중 비누화조작을 생략하고, 고속액체크로마토그래프에 직접 주입할 수 있다. 이 경우에는 유지 약 1 g을 정밀히 달아(W g) n-헥산으로 녹여 50 mL로 한 후, 그 중 일정량(D mL)을 취해 헥산으로 희석한 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험방법

가) 고속액체크로마토그래프 조건

(1) 칼럼：순상형 칼럼

(2) 이동상：헥산․이소프로판올(98：2)

(3) 유속：0.5 mL/분

(4) 검출기：형광검출기(여기파장 298 nm, 측정파장 325 nm)

5) 정량시험

시험용액 1.0 mL에 토콜(tocol)표준용액 1.0 mL를 가해(S) 이의 10 μL를 고속액체크로마토그래프용 칼럼에 주입하여 얻은 토코페롤 동족체의 피크 넓이 또는 높이(Ptoc) 및 토콜(tocol)의 피크 넓이 또는 높이(Pint)를 구한다. 또한 토코페롤 동족체 각각에 대하여 각 토코페롤 표준용액 1.0 mL를 취해 이에 토콜(tocol)표준용액 1.0 mL를 가해 이의 10 μL를 액체크로마토그래프에 주입하여 얻은 각 토코페롤 동족체의 피크 넓이 또는 높이(P st-toc )와 토콜(tocol)의 피크 넓이 또는 높이 (P st-toc )를 구하고, 이들의 중량(mg)에서 토코페롤 동족체의 토콜(tocol)에 대한 환산계수(F)를 구한다. 검체중 토코페롤 동족체의 함량(mg/100 g)은 다음 계산식에서 구한다.

가) 계산방법

(1) 일반시료 및 축산물의 경우(버터등 유지류를 제외한다)

토코페롤동족체의 양(mg/100 g) ＝	S	×	Ptoc	×	F	×	100
			Pint				W

S：시험용액에 함유된 토콜(tocol)의 함량(mg)

S＝V×C

V：검체에 첨가한 토콜(tocol)표준용액의 양(mL)

C：검체에 첨가한 토콜(tocol)표준용액의 농도(mg/mL)

Ptoc：시험용액중 토코페롤동족체 피크의 넓이 또는 높이

Pint：시험용액중 토콜(tocol) 피크의 넓이 또는 높이

F：환산계수

Fα-δ＝	Cst-toc	×	Pst-int
	Cst-int		Pst-toc

Cst-toc：표준용액중 토코페롤 동족체의 농도

Pst-toc：표준용액중 토코페롤동족체 피크의 높이 또는 넓이

Cst-int：표준용액중 토콜(tocol)의 농도

Pst-int：표준용액중 토콜(tocol) 피크의 높이 또는 넓이

W : 검사시료채취량(g)

(2) 버터 등 유지류의 경우

토코페롤 동족체의 양(mg/100 g)	＝	S	×	50	×	Ptoc	×	F	×	100
				D		Pint				W

나. 고속액체크로마토그래프에 의한 정량(제2법)

1) 시험법 적용범위

조제유류에 적용한다.

2) 분석원리

시료 중의 비타민E를 에탄올과 피로갈롤에탄올 용액으로 비누화시키고 석유에테르로 추출 후 감압건조시켜 역상칼럼으로 분리한 후 고속액체크로마토그래프/자외부흡광 검출기를 이용하여 정량하는 방법이다.

3) 장치 및 기구

가) 장치

고속액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(HPLC/UV)

나) 기구

(1) 환류냉각장치

(2) 감압농축기

(3) 용매여과장치

(4) 초자기구 : 분액깔때기(갈색), 둥근바닥플라스크(갈색, 125 mL 또는 250 mL)

(5) 분석저울 : 0.1 mg까지 측정이 가능한 것

4) 시약 및 시액

가) 에탄올, 메탄올, 석유에테르 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 피로갈롤, 수산화칼륨, 페놀프탈레인, 무수황산나트륨 : 특급시약 또는 이와 동등한 것

다) 증류수 : 3차 증류수로 18 MΩ 이상인 것

라) 10% 피로갈롤에탄올용액 : 피로갈롤 10 g을 에탄올에 녹여 100 mL이 되게 한다.

마) 90 % 수산화칼륨용액 : 수산화칼륨 9 g을 증류수에 녹여 10 mL이 되게 한다.

바) 이동상 : 메탄올 950 mL에 증류수 50 mL를 혼합하고 0.45 μm 나일론 필터로 여과하고 탈기하여 사용한다.

5) 표준용액 조제

가) 표준원액: 토코페롤 (α, β, γ, δ)를 각각 50 mg을 채취하여 50 mL 갈색 부피플라스크에 넣고 메탄올로 용해하면서 용량을 맞춘다.

나) 표준용액: 표준원액을 1 mL 취하여 메탄올로 10 mL까지 채워 100 ㎍/mL이 되도록 조제한다.

다) 검량곡선표준용액 : 표준용액을 0.2, 0.5, 1, 2 및 5 mL를 각각 취하여 10 mL까지 메탄올로 채워 2, 5, 10, 20 및 50 ㎍/mL이 되도록 조제한다.

6) 시험용액 조제

시료 약 1 g을 정밀히 취하여 제1법 3)시험용액의 조제 가)에 따라 시험하고 최종 감압 건고물에 메탄올 1 mL을 가하여 용해시키고 0.2 μm 나일론 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

7) 시험방법

가) 고속액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C8(4.6×150 mm, 5 μm) 또는 C18(3.9×150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 칼럼온도 : 30℃

- 이동상 : 95% 메탄올

- 유속 : 1.0 mL/min

- 검출파장 : UV 298 nm

- 주입량 : 10 μL

나) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 주입하고 피크의 머무름 시간을 비교하여 동일 물질인지 정성 확인 후 표준용액의 피크면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액 중의 비타민E의 농도(㎍/mL)를 구하고, 검사시료 중 비타민E의 함량(mg/100 g)을 산출한다.

비타민E 함량(mg/100 g) = C × V/S ×

C : 검량선에서 구한 α, β, γ, δ-토코페롤 합의 농도 (㎍/mL)

V : 시험용액의 최종부피 (mL)

S : 시료 채취량 (g)

: 단위환산

다. α, α＇-디피리딜에 의한 비색정량

1) 장치

분광광도계

2) 시약 및 시액

가) 정색용액：0.5%, α, α＇-디피리딜에탄올용액

나) 염화제이철에탄올용액：염화제이철 0.2 g을 에탄올에 녹여 100 mL로 한다.

다) 석유에테르：석유에테르에 1/10량의 황산을 가하고 황산층이 착색되지 않을 때까지 세척하고 1회 수세한 다음, 순차로 10% NaOH 용액 및 물로 수세한다. 세정한 석유에테르층에 무수황산나트륨을 가하여 탈수한 다음 증류하여 30～60℃에서 유분을 취한다.

라) 표준용액의 조제

α-토코페롤 약 20 mg을 정밀히 달아 에탄올을 가하여 녹여 100 mL로 한다.

3) 시험용액의 조제

토코페롤로 0.5～1 mg에 해당하는 양의 검체를 갈색 둥근바닥플라스크에 취하고 에탄올 30 mL 및 10% 피로가롤․에탄올용액 1 mL를 가하고 수산화칼륨용액(9→10) 1 mL를 가하여 환류냉각기를 부착하고 95℃ 수욕에서 플라스크를 2/3 잠기게 하여 30분간 비누화한다. 비누화 후 신속하게 냉각하여 실온으로 하고 물 30 mL를 가하여 갈색 분액깔때기에 옮기고 플라스크는 물 10 mL, 석유에테르 30 mL로 씻고 씻은 액을 분액깔때기에 옮기고 잘 진탕 혼합하고 방치하여 석유에테르층을 분취한다. 물층은 다음에 석유에테르 30 mL씩으로 2회 추출하고 석유에테르 추출액을 합하여 물 10 mL로 1회, 50 mL씩으로(페놀프탈레인 지시약이 정색되지 않을 때까지) 세척한다. 분액깔때기중에서 물을 충분히 분리한 후, 석유에테르층을 무수황산나트륨에 통과시켜 탈수한 후 갈색 플라스크에 옮긴다. 남은 무수황산나트륨은 석유에테르 10 mL씩으로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 합한다.

석유에테르추출액을 모두 합하여 60℃에서 감압건조하고 잔류물은 에탄올 5 mL로 녹여 25 mL의 갈색플라스크에 옮긴다. 플라스크는 추가로 에탄올 5 mL씩으로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 가하여 에탄올을 채워 25 mL로 하여 시험용액으로 한다.

4) 시험방법

가) 기기 측정조건

시험용액 5 mL와 비타민E 표준용액 1 mL를 25 mL의 플라스크에 취하여 각각에 염화제이철에탄올용액 1 mL와 0.5%, α, α＇󰠅디피리딜에탄올용액 1 mL를 가하고 다음에 에탄올을 가하여 25 mL로 한다. 따로 에탄올 1 mL를 취하여 같은 방법으로 조작한 것을 대조로 하여 시험용액과 표준용액을 액층 1 cm 파장 520nm에서 흡광도를 측정한다.

5) 계산방법

총토코페롤 함량(mg/100 g) ＝ C ×

C：비타민 표준용액의 토코페롤 농도(mg/mL)

Ｔ：시험용액의 흡광도

Ｓ：표준용액의 흡광도

Ｗ：검체채취량(g)