2.2.2.8 비타민K1

가. 액체크로마토그래프에 의한 정량(제2법)

1) 시험법 적용범위

영아용 조제식 및 성장기용 조제식, 조제유류 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료 중 지방을 효소적으로 분해하여 지방산으로 침전시킨 후 헥산으로 비타민K1를 추출하여 역상칼럼으로 분리하고 포스트 칼럼으로 환원시켜 형광을 이용하여 정량하는 방법이다.

3) 장치

액체크로마토그래프/형광검출기(FL Detector)

4) 시약 및 시액

가) 증류수 : 3차 증류수로 18 MΩ 이상인 것

나) Lipase :Candida rugosa를 기원으로 하는 것으로써 약 1,000 unit/mg(Type VII, Sigma L-1754)의 활성이 있는 것 또는 동등한 효소 활성을 가진 것으로써Pseudomonas와Rhizopus를 기원으로 하는 것

다) 40% 수산화칼륨용액 : 40 g KOH를 증류수로 녹여 100 mL로 하여 조제한다.

라) 0.8 M 인산완충용액 : 54.0 g KH2PO4를 물 350 mL에 녹여 40% 수산화칼륨용액으로 pH를 7.9～8.0으로 조정하여 증류수로 희석하여 500 mL로 하여 조제한다.

마) 에탄올, 메탄올 : 액체크로마토그래프용 또는 동등한 것

바) 알콜혼합용매 : 에탄올과 메탄올을 95:5의 부피비로 혼합하여 조제한다.

사) 헥산, 디클로로메탄, 이소프로판올 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

아) 염화아연, 무수초산나트륨, 무수탄산칼륨 : 시약 특급 혹은 이와 동등한 것

자) 초산 : Glacial 급

차) 아연분말 : 입자 60 μm 이하인 것(Merck 108774 또는 BDH 102964L) 또는 이와 동등한 것으로 개봉 후 즉시 사용한다.

카) 이동상 : 메탄올 900 mL에 디클로로메탄 100 mL을 혼합한 용매에 염화아연 1.37 g과 무수초산나트륨 0.41 g 및 초산 0.30 g을 메탄올 5 mL에 녹여 첨가하고 0.45 um 여지로 여과하고 탈기하여 조제한다.

5) 표준용액 조제

가) 표준원액 : 비타민 K1100 mg을 100 mL 이소프로판올에 녹여 조제한다.

나) 표준용액 : 표준원액을 메탄올로 희석하여 2.5 μg/mL이 되도록 조제한다.

다) 검량곡선표준용액 : 표준용액을 각 각 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 및 1.25 mL 취하여 메탄올로100 mL이 되도록 한다.(6.25, 12.5, 18.75, 25.0, 31.25 ng/mL로 조제)

6) 시험용액 조제

※ 시험용액 조제 시 직접적인 태양광에 노출되지 않도록 실험을 진행한다.

가) 분해

고체시료는 1.0 g, 액체시료는 10.0 g을 시험관(200×24 mm ID)에 정밀하게 취하여 40℃이하의 미지근한 물 15 mL을 취하여 교반기를 이용하여 녹인다. 이 때 액체시료의 경우 미지근한 물 5 mL를 첨가한다. 인산완충용액 5.0 mL을 첨가하여 혼합하고 1.0 g의 lipase분말을 넣고 교반기로 혼합한다. 마개를 막고 고르게 균질화될 수 있도록 30～60초간 진탕하고 37±2℃에서 2시간 분해한다. 분해 시 20분 간격으로 15초간 진탕한다. 분해 후 수욕상에 담구어 냉각하고 10 mL 알콜혼합용액을 첨가하여 혼합한 후 1.0 g의 무수탄산칼륨을 첨가하여 혼합한다.

나) 추출

분해가 완료된 시험관에 30 mL 헥산을 첨가하여 마개를 한 후 10분간 격렬히 진탕하고 냉암소에 보관하여 층이 분리되도록 한다. 층분리가 잘 되지 않을 때에는 약 1,000 rpm(200G)로 10분간 원심분리한다. 헥산 상층액을 1.0 mL 취하여 바이얼로 옮기고 질소농축하여 메탄올 1 mL으로 잔류물을 다시 용해하여 시험용액으로 한다.

7) 시험방법

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 분석칼럼 : C
18칼럼으로 carbon loading량이 10% 이상인 것 (4.6 mm×250 mm, 5 ㎛)

(2) 포스트 칼럼 : 4.0 mm I.D×20 mm(WAT084550) 또는 이와 동등한 것 혹은 내경 2.0～4.0 mm 및 길이 30～50 mm 의 액체크로마토그래프 칼럼관에 아연분 말을 채워 제작한 것으로 분석칼럼과 형광검출기 사이에 장착한다.

※ 포스트 칼럼 제작 시 빈 공간이 생기지 않도록 주의하여 아연분말을 채우고 장착하기 전 30분간 이동상을 약 1 mL/min의 유속으로 흘려 평형이 이루어지는지 확인하고 장착 후 30～60분 이상 시스템을 안정화하여 분석한다.

(3) 칼럼온도 : 30℃

(4) 이동상 유속 : 0.8 mL/min

(5) 주입량 : 10 μL

(6) 형광검출기파장 : 여기파장(λex); 243 nm, 측정파장(λem); 430 nm

나) 검량선 작성

검량곡선표준용액을 액체크로마토그래프에 10 uL씩 각각 주입하여 얻어진 크로마토그램 상의 각 피크의 넓이를 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램
 

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램(포스트 칼럼 : 2.0 mmID×35 mm 제작하여 사용)

라) 정량한계 : 180 μg/kg

8) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

9) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크 면적법에 따라 정량한다.

가) 계산방법

비타민K1함량(μg/100 g) =	Y' ×	30	×	1	×	100
		V		S		1,000

Y' = 검량곡선에 대입하여 얻은 시험용액의 농도(ug/L)

V = 시료특성에 따라 취한 헥산의 부피(mL)

S = 시료의 무게(g)