2.2.2.12.1 일반정량조작법

가. 장치 및 기구

1) 항온기

2) 건조기

3) 멸균기

4) 무균대

5) 시험관, 피펫 등：시험균의 증식은 유리기구에 부착된 미량의 비타민 또는 세정제에 의하여 쉽게 영향을 받기 때문에 유리기구는 적당한 계면활성제 등으로 하루 처리한 후 충분히 물로 닦아둔다.

나. 시약 및 시액

1) 시약

사용시약류는 가능한 한 순수한 시판품을 이용하고 검량선 작성을 위한 표준품은 표준비타민을 이용한다.

2) 시험균의 보존

유산균류는 고층한천배지에, 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 유산균과 효모용 보존배지의조성은 다음과 같다. 유산균은 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH2PO40.2%, 한천 1.5%의 조성으로 하고, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5%로 한다. 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 pH를 6.8～7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10 mL씩 시험관에 분주하여 멸균한다. 균은 접종하여 유산균은 37℃, 효모는 30℃에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5℃에 보존하면서 1～3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 동결건조법에 의해 보존한다.

3) 접종균액

유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, 염류용액A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다. 이 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16～24시간 정도 같은 배지에 2～3회 배양한다. 증식된 균체는 3,000 rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5～100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다.

4) 정량용 기초배지

가) 염류용액 A

KH2PO4와 K2HPO4각 5 g을 물에 녹여 전량을 100 mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

나) 염류용액 B

MgSO4․7H2O 2 g, NaCl 0.1 g, FeSO4․7H2O 0.1 g 및 MnSO4․4H2O 0.1 g을 물에 녹여 전량을 100 mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

다) 카제인 산분해용액

비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100 g을 95% 알코올로 2회 세정하여, 5배 양의 20% HCl을 가해서 8～12시간 동안 가열환류하거나 또는 멸균기에서 121℃로 8～12시간 가열한다. 계속해서 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200 mL를 가해 감압하에서 HCl을 제거한다. 잔류물을 물에 녹이고 10% NaOH를 가하여 pH를 3.5±0.1로 조정하고 여기에 물을 가하여 1 L로 만든다. 계속해서 활성탄 20 g을 가해 1시간 정도 혼합한 후 여과한다. 여액이 담황색 또는 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이한 후, 소량의 톨루엔을 가하여 냉암소에 보관한다. 보관 중 침전이 생기면 여과해서 사용한다.

다. 시험방법

1) 기기 측정조건

특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5 mL 또는 10 mL로 한다. 정량하고자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용하고, 각 농도에 관해서 2～3개씩 4～8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4～6개 준비한다. 총량이 5 mL일 경우 기초배지는 2.5 mL를 사용하고, 10 mL일 경우 기초배지는 5 mL를 가한 후, 물을 가해서 각각 5 mL 또는 10 mL로 만든다. 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2～3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으로 한다. 분주가 끝나면 면전하여 121℃의 조건에서 5분간 가압살균한다. 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2～3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30～37℃에서 16～24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다. 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10 mm 직경의 흡수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도계에서 540～610 nm의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다. 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다.

2) 검량선 작성

검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 mL수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다. 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다. 계속해서 시험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 검체의 g수 또는 검체용액 mL수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다. 이때 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다.

라. 정량시험

1) 계산방법

표준용액 및 시험용액은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1 mL 또는 검체 1 g당의 함유량을 구해 다음의 계산법에 따라 검체중의 비타민 함량을 산출한다.

비타민 함량	＝	시험용액의 비타민함량	×	희석농도
				검체량