2.2.2.12.2 비타민B6

가. 시약 및 시액

1) 비타민B6보존용액

H2SO4를 넣은 감압 데시케이터에서 24시간 건조된 비타민B6표준품 50 mg을 정밀하게 취하여, 500 mL의 메스플라스크에 넣고 1N HCl을 가하여 전량을 500 mL로 만든 후 갈색유리병에 넣어 냉소에 보관한다. 이 용액 1 mL는 피리독신염산염 100 μg을 포함한다.

2) 비타민B6표준용액

비타민B6보존용액을 물로 희석해서 1 mL에 피리독신염산염 5 μg을 포함하도록 한다. 사용시 조제한다.

3) 카제인 산분해용액

2.2.2.12.1 일반정량조작법 sk. 4) 정량용 기초배지에 따른다.

4) 비타민B1용액

비타민B1염산염 10 mg을 물에 용해해서 1,000 mL로 만든다. 이 용액 1 mL는 비타민B1염산염 10 μg을 포함한다.

5) 이노시톨용액

이노시톨 100 mg을 물에 용해해서 100 mL로 만든다. 이 용액 1 mL는 이노시톨 1 mg을 포함한다.

6) 비오틴용액

비오틴 25 mg을 물에 용해해서 1,000 mL로 만든 후 이중 40 mL를 취해 물을 가하여 1,000 mL로 만든다. 이 용액 1 mL는 비오틴 1 μg을 포함한다.

7) 판토텐산칼륨용액

판토텐산칼륨 20 mg을 물에 용해해서 100 mL로 만든다. 이 용액 1 mL는 판토텐산칼륨 0.2 mg을 포함한다.

8) 나이아신용액

나이아신 100 mg을 물에 용해해서 100 mL로 만든다. 이 용액 1 mL는 나이아신 1 mg을 포함한다.

9) 염류용액

KH2PO42.2 g, KCl 1.7 g, CaCl2․2H2O 0.5 g, MgSO4․7H2O 0.5 g, MnSO4․4H2O 0.01 g및 FeCl30.01 g을 물에 용해해서 전량을 100 mL로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다.

10) 구연산완충액

구연산칼륨 10 g과 구연산 2 g을 물에 녹여 전량을 100 mL로 만든다.

11) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10 mL, 비타민B1용액 5 mL, 이노시톨용액 5 mL, 비오틴용액 2 mL, 판토텐산칼륨용액 2.5 mL, 나이아신용액 0.5 mL, 염류용액 50 mL 및 구연산완충액 10 mL를 혼합하고 여기에 포도당 10 g을 가하여 녹인다. 10% NaCl 용액으로 pH를 5.0～5.2로 조정한 후 물을 가하여 전량을 100 mL로 만든다. 용해되지 않은 물질이 있으면 여과한다. Pyridoxine assay medium(Difco 배지)을 사용할 수 있다.

12) 접종균액의 조제

가) Saccharomyces pastorianus의 보존균주

Saccharomyces pastorianusATCC 9080을 효모용 한천사면배지 또는 Wort agar(Difco 배지)에 접종하여, 30℃에서 16～24시간 배양 후 냉소에 보관한다. 보관균주는 2주 간격으로 새로 배양한다.

나) 배지

기초배지 100 mL에 피리독신염산염 1 μg을 포함한 물 100 mL를 가하여 접종균액 조제용 배지로 한다. 이 배지를 소시험관에 2 mL씩 분주하여 면전한 후 121℃에서 10분간 가압멸균하여 방냉한다.

다) 접종용액

Saccharomyces pastorianus의 보존균주를 멸균된 배지에 접종하여 30℃에서 16～24시간 배양한다. 배양균을 원심분리하여 취한 후 이를 0.9% NaCl용액으로 2회 세척하고, 0.9% NaCl용액을 이용해서 약 20배로 희석하여 접종용액으로 한다.

나. 시험용액의 조제

검체 2 g을 500 mL의 삼각플라스크에 취하여, 10 N HCl 1 mL 및 물 180 mL를 가하여 뚜껑을 하고 121℃에서 4시간 가압 추출한다. 식힌 후 10% NaOH용액으로 pH를 4.5로 조정하고, 여기에 물을 가하여 전량을 200 mL로 만든다. 필요시 여과한다. 시험용액 1 mL가 비타민B6약 5 μg을 포함하도록 여액을 물로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.

다. 시험방법

비타민B6표준용액의 계열을 만들기 위해서, 2개씩의 시험관에 비타민B6표준용액 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 및 4.0 mL를 각각 취하고, 각 시험관에 기초배지 5 mL 및 물을 가해서 전량을 10 mL로 만든다. 특히 시험용액의 계열을 만들기 위해서 2개씩의 시험관에 시험용액 1.0, 1.5, 2.0 및 3.0 mL를 가하고 각 시험관에 기초배지 5 mL 및 물을 가해서 전량을 10 mL로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 혼합해서 면전한 후 100℃에서 10분간 멸균하여 식히고, 각 관에 접종용액 한 방울씩을 무균적으로 접종하여 30℃에서 16～24시간 배양한다. 배양 후 균의 증식을 정지시키기 위하여 100℃에서 5분간 멸균한 후 탁도법에 의하여 균의 증식을 측정한다.