2.2.2.12.3 엽산

가. 시약 및 시액

1) 엽산 보존용액

P2O5를 넣은 데시케이터에서 건조시킨 엽산 표준품 50 mg을 정확하게 취하여 500 mL의 메스플라스크에 넣어 0.01 N NaOH용액 약 30 mL로 녹이고, 물 약 300 mL를 가한 후 HCl로 pH를 7～8로 조정하고 물을 가하여 500 mL로 만든다. 톨루엔을 가하여 약 10℃로 보존한다. 이 용액 1 mL는 엽산 100 μg을 포함한다.

2) 엽산 표준용액

엽산 보존용액을 물로 희석해서 1 mL에 엽산 2 μg을 포함하도록 한다. 사용시 조제한다.

3) 시스틴-트립토판 용액

L-시스틴 2 g 및 L-트립토판 0.5 g(또는 DL-트립토판 1 g)을 350～400 mL의 물로 희석하여 70～80℃로 가열하고, 고형물이 녹을 때까지 20% HCl을 첨가한다. 식힌 후 물을 가해서 전량을 500 mL로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.

4) 아데닌-구아닌-우라실용액

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1 g을 20% HCl 5 mL로 가열하면서 녹이고 식힌 후 물을 가하여 100 mL로 만든다. 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.

5) 카제인 산분해용액

2.2.2.12.1 일반정량조작법 나. 4) 정량용 기초배지에 따른다.

6) 염류용액 B

2.2.2.12.1 일반정량조작법 나. 4) 정량용 기초배지에 따른다.

7) 크산틴 용액

물 약 80 mL에 크산틴 0.4 g을 가하여 70℃로 가열하면서 10% 암모니아수 12 mL를 가하여크산틴이 녹을 때까지 젓는다. 식힌 후 물을 가하여 400 mL로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

8) 비타민 용액

파라아미노안식향산 10 mg, 피리독신염산염 40 mg, 비타민B1염산염 4 mg, 판토텐산 칼륨 8 mg, 나이아신 8 mg 및 비오틴 0.2 mg을 약 300 mL의 물로 녹이고, 여기에 비타민B1210 mg을 0.02N 초산으로 녹인 용액 200 mL를 가한다. 계속해서 무수초산나트륨 1.9 g과 초산 1.6 mL를 40 mL의 물로 녹인 용액을 가한 후, 물을 가해서 2 L로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

9) 아스파라긴 용액

L-아스파라긴 8 g을 물에 용해해서 800 mL로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

10) MnSO4용액

MnSO4․4H2O 2 g을 물에 용해해서 200 mL로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

11) 폴리솔베이트 80 용액

폴리솔베이트 80(Polyoxyethylene sorbitan monooleate) 25 g을 에탄올로 녹여 250 mL로 만든다.

12) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10 mL, 시스틴-트립토판용액 20 mL, 아스파라긴용액 3 mL, 아데닌-구아닌-우라실용액 1 mL, 크산틴용액 2 mL, 비타민용액 20 mL, 염류용액B 2 mL, MnSO4용액 2 mL 및 폴리솔베이트80용액 0.1 mL를 잘 섞고, 여기에 포도당 4 g, 인산이칼륨(K2HPO4) 0.64 g 및 구연산나트륨(C6H5O7Na3․2H2O) 5.2 g을 가하여 녹이고, 10% NaOH용액으로 pH를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 100 mL로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다.

Folic acid assay medium(Difco 배지)을 사용할 수 있다.

13) 접종균액의 조제

가) Streptococcus faecalis의 보존균주

물 100 mL에 효모엑기스 2 g을 녹이고 여기에 포도당 0.5 g을, 무수초산나트륨 0.5 g을가하여 pH를 6.8로 조정한다.

수욕상에서 10～20분간 가열하여 여과한 후 한천 1.5 g을 가하여 한천이 용해될 때까지수욕상에서 세게 혼합하면서 가열한다. 뜨거운 상태에서 10 mL씩을 시험관에 분주하여 면전하고 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 시험관을 수직으로 세워 식힌다.

Streptococcus faecalisATCC 8043의 보존균주를 멸균된 배지 10 mL에 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양하여 냉소에 보관한다. 보존균주는 매주 새로 배양하고 1주를 넘은 것은 사용하지 않는다.

나) 배지

한천을 제외한 보존배지로 조제한 액체배지 2 mL를 소시험관에 분주하여 면전한 후, 121℃에서 10분간 가압멸균하여 방냉한다.

다) 접종균액

Streptococcus faecalis의 보존균주로부터 멸균된 배지에 접종하여, 37℃에서 16～24시간 배양 후 증식된 균체를 무균적으로 원심분리하고, 0.9% NaCl 용액으로 2회 세척한 후, 0.9% NaCl용액 약 2 mL를 가해서 접종균액으로 한다.

나. 시험용액의 조제

일정량의 검체를 플라스크에 넣고, 여기에 적어도 검체의 10배량의 물을 가한다. 이 때 이 액 1 mL는 엽산 1 mg 이상을 포함하여야 한다. 여기에 약 10% 암모니아수를 100 mL당 2 mL의 비로 가해서 잘 섞고, 가압멸균기에 넣어 121℃에서 약 15분간 가열한 후 식혀, 물을 가해 일정량으로 하여 여과 또는 원심분리하여 투명한 용액으로 만든다. 다음에 pH를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 적당히 희석한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 1 mL는 엽산 약 2 μg을 포함하도록 조제한다.

다. 시험방법

엽산표준용액의 계열을 만들기 위해서 시험관 2개씩에 엽산표준용액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 1.75 및 2.0 mL를 취하여 각 시험관에 기초배지 2 mL 및 물을 가해서 각각 4 mL로 만든다. 시험용액의 계열은 시험관 3개씩에 시험용액 0.5, 1.0 및 1.5 mL를 가하고 각 시험관에 기초배지 2 mL 및 물을 가하여 4 mL로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 섞어 면전하고 121℃에서 5분간 가압멸균하여 식힌 후 각 시험관에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하여 37℃에서 20～24시간 배양한다. 탁도법에 의하여 균의 증식도를 측정한다.