2.2.2.12.4 판토텐산

가. 시험법 적용범위

영아용조제식, 성장기용조제식, 조제유류 등 식품에 적용한다.

나. 시약 및 시액

1) 판토텐산칼륨 보존용액

P2O5를 넣은 데시케이터중에서 건조시킨 판토텐산칼륨 표준품 50 mg을 정확하게 취하여, 1 L의 메스플라스크에 넣고 약 500 mL의 물을 가하여 용해한다. 여기에 0.2 N 초산 10 mL, 2% 초산나트륨 100 mL 및 물을 가해서 1,000 mL로 만든다. 톨루엔을 소량 가하여 냉소에 보관한다. 판토텐산칼륨 보존용액 1 mL에는 판토텐산칼륨 50 μg을 포함한다.

2) 판토텐산칼륨 표준용액

판토텐산칼륨 보존용액을 희석하여 1 mL당 판토텐산칼륨 0.5 μg을 포함하도록 한다. 사용시조제한다.

3) 카제인 산분해용액

2.2.2.12.1 일반정량조작법 나. 4) 정량용 기초배지에 따른다.

4) 시스틴-트립토판 용액

L-시스틴 2 g 및 L-트립토판 0.5 g을 350～400 mL의 물로 녹이고 70～80℃로 가열하여 고형물이 완전히 녹을 때까지 20% HCl을 떨어뜨린다. 식힌 후 물을 가해서 전량을 500 mL로 만들고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

5) 아데닌-구아닌-우라실용액

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1 g을 20% HCl 5 mL로 가열하면서 녹이고 식힌 후 물을 가하여 100 mL로 만든다. 톨루엔 소량을 가해서 약 10℃로 보존한다.

6) 비타민B1-비타민B 2-비오틴용액

비타민B1염산염, 비타민B2및 비오틴을 0.02 N 초산에 용해하여, 그 1 mL에 비타민B1염산염 10 μg, 비타민B220 μg 및 비오틴 0.04 μg을 포함하도록 한다. 톨루엔을 소량 가하여 빛을 차단하고 냉소에 보관한다.

7) 염류용액A

2.2.2.12.1 일반정량조작법 나. 4) 정량용 기초배지에 따른다.

8) 염류용액B

2.2.2.12.1 일반정량조작법 나. 4) 정량용 기초배지에 따른다.

9) 파라아미노안식향산-나이아신-비타민B6용액

보존용액 1 mL에 파라아미노안식향산 10 μg, 나이아신 20 μg 및 피리독신염산염 40 μg을 포함하도록 25% 에탄올로 용해하여 냉소에 보관한다.

10) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10 mL, 시스틴-트립토판용액 10 mL, 아데닌-구아닌-우라실용액 2 mL, 비타민B1-비타민B2-비오틴용액 2 mL, 파라아미노안식향산-나이아신-비타민B6용액 2 mL, 염류용액A 2 mL 및 염류용액B 2 mL를 혼화하여 여기에 포도당 4 g 및 무수초산나트륨 2 g을 가해서 녹이고, 10% NaOH용액으로 pH를 6.8로 조정한 후 물을 가해서 전량을 100 mL로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다. Pantothenate medium(Difco 배지)을 사용할 수 있다.

11) 접종균액의 조제

가) Lactobacillus plantarum의 보존균주

물 100 mL에 효모엑기스 2 g을 녹이고, 여기에 포도당 0.5 g, 무수초산나트륨 0.5 g을 가해 pH를 6.8로 조정한 후 수욕상에서 10～20분간 가열하여 여과한다. 한천 1.5 g을 가해 한천이 녹을 때까지 수욕상에서 세게 진탕하면서 가열한다. 뜨거운 상태에서 10 mL씩 시험관에 분주하여 면전하고, 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 시험관을 똑바로 놓고 식힌다.Lactobacillus plantarumATCC 8014의 보존균주로부터 멸균된 배지에 접종한 후 37℃에 16～24시간 배양하여 냉소에 보관한다. 보존균주는 매주 새로 조제하고 1주가 넘은 것은 사용하지 않는다.

나) 배지

기초배지 5 mL를 넣은 시험관에 판토텐산칼륨 0.2 μg을 포함한 물 5 mL를 가하고 면전을 하여, 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 식힌다. Bacto micro inoculum broth(Difco 배지)를 사용할 수 있다.

다) 접종균액

Lactobacillus plantarum의 보존균주를 멸균된 배지 10 mL에 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양한다. 배양액을 잘 진탕혼합한 후 그대로 접종균액으로 사용한다.

다. 시험용액의 조제

검체에 10배 용량의 물을 가하여 잘 섞으면서 초산 및 초산나트륨 용액으로 pH를 5.6～5.7로 조정한다. 이를 가압멸균기에 넣고, 121℃에서 약 5분간 가열한 후 식힌다. 필요하면 10% HCl을 가해 pH를 4.0～4.5로 조정하여 단백질 등을 침전, 제거시키고 투명한 액으로 만든다. 다음에 NaOH용액을 가해서 pH를 6.8로 조정하고 물을 가하여 용액 1 mL에 판토텐산 약 0.05 μg을 포함하도록 희석한다.

라. 시험방법

1) 기기 측정조건

판토텐산칼륨 표준용액의 계열을 만들기 위해서, 시험관 2개씩에 판토텐산칼륨 표준용액을각각 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75 및 2.0 mL를 취하고, 각 시험관에 기초배지 2 mL및 물을 가해서 전량을 4 mL로 만든다. 시험용액을 만들기 위해서는 시험용액을 각각 0.5, 1.0 및 1.5 mL를 취하고 각 시험관에 기초배지 2 mL 및 물을 가하여 전량을 4 mL로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 혼합한 후 면전하여 121℃에서 5분간 가압멸균하고 식힌 후 각 시험관에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하여, 37℃에서 20～24시간 배양한다. 배양 후 각 시험관의 내용물을 잘 진탕 혼합하여 균일한 현탁액(suspension)으로 만든 후 540～660 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.

2) 검량선작성

판토텐산칼륨 표준계열에 의한 흡광도의 평균치로부터 검량선을 작성한다.

마. 계산방법

상기 검량선을 이용하여 검체계열의 각 시험관의 판토텐산칼륨 함량을 구한다. 이 때 값이 0.09 μg이상 또는 0.01 μg이하의 것이 있으면 제외하고, 남은 각 관에 대하여 시험용액 1 mL에 대한 판토텐산칼륨의 함량을 계산한다. 6개 이상의 시험관으로부터 얻어진 각각의 값이 그들의 평균치보다 10%이상 벗어나지 않는 것을 확인한 다음에 이 값만의 평균치를 구하여 검체중의 판토텐산칼륨의 함량을 산출한다. 그 다음에 여기에서 얻은 값으로 환산계수 0.916을 곱해서 판토텐산 함량을 구한다.