2.2.2.12.5 비타민B12

가. 시험법 적용범위

영아용조제식, 성장기용조제식, 조제유류 등 식품에 적용한다.

나. 시약 및 시액

1) 시아노코발아민 보존용액

데시케이터 중에서 건조시킨 시아노코발아민 표준품을 시아노코발아민의 양이 50～60 μg에 해당되도록 정확히 칭량하여 25% 알코올을 가한 후 mL당 100 ng의 농도가 되도록 표준용액 농축액을 만든다. 농축액은 10℃에 보관한다.

2) 시아노코발아민 표준용액

이 용액에 일정량의 증류수를 가하여 500 mL로 희석한다. 이 표준용액의 농도는 mL당 0.01～0.04 ng에 해당하는 농도로서, 검체의 농도와 유사하도록 한다. 같은 방법으로 검체중의 비타민B12농도보다 높은 농도 및 낮은 농도(예：0.010 ng/mL와 0.020 ng/mL)의 표준용액을 준비한다.

3) 아데닌-구아닌-우라실 용액

아데닌황산염, 구아닌염산염, 우라실 1.0 g을 50 mL의 가온한 HCl로 용해하고(1＋1) 물을 가하여 1 L로 만든다.

4) 아스파라긴 용액

L-아스파라긴 10 g을 물로 녹이고 1 L로 만든다.

5) 폴리솔베이트 80 용액 폴리솔베이트 80 25 g을 알코올로 녹여 250 mL로 만든다.

6) 염류용액A

2.2.2.12.1 일반정량조작법 나. 사) 정량용 기초배지에 따른다.

7) 염류용액B

2.2.2.12.1 일반정량조작법 나. 사) 정량용 기초배지에 따른다.

8) 비타민용액 Ⅰ

비타민B225 mg, 비타민B1염산염 25 mg, 비오틴 0.25 mg, 나이아신 50 mg을 0.02N 초산으로 녹이고 1 L로 만든다.

9) 비타민용액 Ⅱ

파라아미노안식향산(PABA) 50 mg, 판토텐산 25 mg, 피리독신 염산염 100 mg, 피리독살 염산염 100 mg, 피리독사민 염산염 20 mg, 엽산 5 mg을 25% 알코올로 녹이고 1 L로 만든다.

10) 현탁배지(suspension medium)

기초배지 5 mL를 동량의 물로 희석하여 시험관에 넣고 면전하여 121℃에서 15분간 멸균한 후 빨리 식힌다. 10℃의 암소에 저장한다.

11) 크산틴용액

크산틴 1.0 g을 150～200 mL의 물로 녹이고 약 70℃로 가열하면서, 30 mL의 NH4OH(2＋3)를 넣고 완전히 녹을 때까지 저은 후 물을 가하여 1 L로 만든다.

12) 카제인 산분해용액

2.2.2.12.1 일반정량조작법 나. 4) 정량용 기초배지에 따른다.

13) 기초배지

비타민B12가 포함되어 있지 않은 2배농도의 기초배지 1 L를 준비하기 위하여 다음의 물질들을 순서대로 첨가한다. 아데닌-구아닌-우라실용액 20 mL, 아스파라긴용액 20 mL, 염류용액A 20 mL, 염류용액B 20 mL, 비타민용액Ⅰ40 mL, 비타민용액Ⅱ 40 mL, 크산틴용액 20 mL, 폴리솔베이트80 용액 20 mL를 넣은 후 증류수를 가하여 약 800 mL로 만든다. 계속해서 다음 물질들을 순서대로 가한다. 산가수분해 카제인 10 g, L-시스틴 0.4 g, DL-트립토판 0.4 g을 최소량의 묽은 염산(236 mL 진한염산/L)으로 녹인 용액과 포도당 40 g, sodium acetate trihydrate 33.2 g, 아스코르빈산 4 g을 넣는다. 아스코르빈산을 가한 후에는 강하게 교반하지 않아야 한다. 모든 고형분이 완전히 녹을 때까지 가볍게 젓는다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 조정한다. 지시약을 사용할 때는 지시약이 폴리솔베이트를 흡수하기 때문에 pH를 조정한 후 폴리솔베이트용액을 넣는다. vitaminB12assay medium(Difco 배지)을 사용할 수 있다.

14) 접종균액의 조제

가) Lactobacillus leichmannii의 보존균주

Lactobacillus leichmanniiATCC 7830은 배양배지에 천자배양(stab culture)한다. 37℃에서 6～24시간 배양하여 10℃의 암소에서 저장한다. 분석하기 전 1～2주 간격으로 계속 배양하고, 최소한 1주일에 1번 정도로 새로 준비한다.

나) 액체배양배지

Peptonized milk 15 g, 효모엑기스 5 g, 포도당 10 g, KH2PO42 g을 600 mL의 물로 용해한다. 여기에 여과한 tomato juice 100 mL를 가한 후 NaOH로 pH를 6.5～6.8로 조정한다. 저으면서 10 mL의 폴리솔베이트80을 첨가하고 물로 희석하여 1 L로 만든다. Lactobacilli broth AOAC(Difco 배지)를 사용할 수 있다. 1 mL당 1 ng의 비타민B12를 포함하도록 동량의 물로 희석하여 시험관에 10 mL씩 분주한 후, 면전하여 121℃에서 15분간 멸균하여 빨리 식히고 냉장고에 보관한다.

다) 배양배지

액체배양배지 500 mL에 5～7.5 g의 agar를 넣고 agar가 녹을 때까지 수욕상에서 젓는다.뜨거운 상태에서 10 mL를 취하여 시험관에 넣고 121℃로 15분간 멸균한 후 똑바로 세워빨리 식히고 10℃의 암소에 저장한다. Lactobacilli agar AOAC(Difco 배지)를 사용할 수 있다.

라) 접종균액

L. leichmannii의 보관균주를 2개의 액체배양배지에 접종하여 37℃에서 6～24시간 배양 후 원심분리하여 상등액은 버리고 0.9% NaCl용액 또는 현탁배지(suspension medium) 10 mL로 3회 세척한다. 현탁배지(suspension medium)를 100% T로 고정하고 이에 대하여 판독할 때, 시험관당 0.50～0.75의 건조량에 상응되는 T 값이 주어지도록 0.9% NaCl용액 또는 현탁배지(suspension medium)로 일정량을 희석한다. 이렇게 준비한 것을 접종액으로 한다.

다. 시험용액의 조제

Na2HPO41.3 g, 구연산 1.2 g, sodium metabisulfite(Na2S2O5) 1.0 g을 넣은 용액 100 mL를 사용전에 준비한다. 비타민B12의 농도가 50～100 ng이 되도록 검체의 양을 취한 후 mL당 0.01에서 0.04 ng의 비타민B 12최종분석 농도에서 추출용액을 sodium metabisulfite의 농도가 mL당 0.03 mg을 넘지 않도록 첨가한다. 액상으로 검체용액을 완전히 분산시키고 물로 비커의 아래부분을 세정하여 혼합물을 121℃에서 10분간 멸균하여 식힌다. 만일 덩어리가 생기면 입자가 완전히 녹을 때까지 혼합물을 젓는다. 세게 흔들면서 pH를 4.5로 조정하고, 비타민B 12의 농도가 mL당 0.2 ng이 되도록 물로 희석하여 여과한다. pH를 6.0으로 조정한 후 물을 가하여 적당히 희석한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 1 mL는 비타민B 120.014 ng을 포함하도록 조제한다.

라. 시험방법

1) 기기 측정조건

비타민B12의 표준용액과 분석용액의 계열을 다음과 같이 준비한다. 두 개의 시험관에 표준용액을 0(비접종 blank), 0(접종 blank), 1.0, 2.0, 3.0, 4.0과 5.0 mL씩 넣는다.

분석검체는 2개 시험관에 분석용액을 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 mL씩 넣는다. 표준용액과 분석용액의 각 시험관에 물을 넣어 5 mL로 만든 후, 5 mL의 기초배지를 넣고 잘 섞는다. 면전하여 121℃에서 10분간 고압멸균하여 빨리 식힌다. 비접종 공시험용 시험관을 제외한 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양한다. 각 시험관의 내용물을 완전히 혼합하여 흡수 cell에 옮기고, 비접종 시험관의 투과도를 100%로 고정하여 각 시험관의 투과도를 구한다.

2) 검량선 작성

시아노코발아민 표준계열에 의한 흡광도의 평균치로부터 검량선을 작성한다. 표준곡선으로부터 분석용액의 각 시험관의 비타민양을 정한다. 표준용액의 T값이 0.5 mL이하 또는 4.5 mL이상으로 관찰되면 무시한다.

마. 정량시험

1) 계산방법

시험에 사용한 분석용액의 농도(비타민함량/mL)를 계산한다. 각 시험관 결과치의 평균을 구하되, 평균으로부터 10%이내의 오차를 보이는 결과만을 취하여 계산한다. 분석용액의 4단계에 사용한 시험관중 2/3미만이 적합한 결과를 보인 경우, 이 결과는 검체의 비타민B12함량 결정에는 불충분하다. 2/3이상의 시험관의 결과가 적합한 경우라면, 그 평균값으로부터 검체의 역가를 구한다.