2.2.2.12.6 콜린

가. 시험법 적용범위

영아용조제식 등 식품에 적용한다.

나. 시약 및 시액

1) 콜린 표준용액：80℃에서 24시간 감압건조한 염화콜린 표준품을 정밀하게 취하여 염화콜린 으로서 5 μg/mL의 수용액으로 조제하여 냉소에 보관한다.

2) 비오틴용액：비오틴 25 mg을 물에 용해해서 1,000 mL로 만든 후 이 중 40 mL를 취해 물을 가하여 1,000 mL로 만든다. 이 용액 1 mL는 비오틴 1 μg을 포함한다.

3) 염류용액：H3BO30.01 g, Na2MoO4․2H2O 0.02 g, FeSO4․7H2O 0.2 g, CuSO4․5H2O 0.08 g, MnSO4․4H2O 0.02 g 및 ZnSO4․7H2O 1.8 g을 물에 녹여 1 L로 한다. 톨루엔을 가하여 보관한다.

4) 기초배지의 조제

자당 20 g, 주석산 암모늄 5 g, 질산암모늄(NH4NO3) 1 g, 제일인산칼륨(KH2PO4) 1 g, 황산 마그네슘(MgSO 4․7H2O) 0.5 g, 염화나트륨(NaCl) 0.1 g, 염화칼슘 0.1 g, 비오틴용액 5 mL, 염류용액 5 mL 및 물 400 mL를 가하고, 가열하여 용해시키고, 10% 염산으로 pH를 5～5.2로 조정하고, 물을 가하여 500 mL로 한다. 불용물질이 있으면 여과한다. 또는 이와 동등한 합성배지를 사용할 수 있다.

5) 접종균액의 조제

가)Neurospora crassa의 보존균주：기초배지 100 mL에 효모엑기스 0.4 g, 맥아엑기스 0.4 g, 염화콜린 1 mg 및 물 100 mL를 가하여 용해하고, 여기에 한천 3 g을 가하여 수욕상에서 가열용해한다. 식기전에 이액 10 mL씩을 시험관에 넣어 면전하고, 1 kg/cm2로 10분간 가압멸균하고, 방냉하여 사면배지를 만든다.Neurospora crassaNo. 34486(콜린 요구성 변이주)의 순수배양을 이용하여 배지에 접종하고, 30℃로 3일간 배양하여, 실내에 1일간 방치하여 포자를 형성시킨 후, 냉소에 보관한다. 보존균주는 2주마다 다시 조제한다.

나) 접종균액：Neurospora crassa의 보존균주에 멸균 0.9% 염화나트륨용액 10 mL를 가하여, 잘 흔들어 섞어 포자를 부유시켜, 이 액을 접종균액으로서 사용한다.

다. 시험용액의 조제

미세하게 분쇄한 검체 일정량을 삼각플라스크에 넣고, 여기에 검체의 적어도 10배량의 0.1 N 황산용액을 가하여, 수욕상에서 약 15분간 가열추출한다. 냉각 후 10% 수산화나트륨용액을 이용하여 pH를 약 5로 조정한 후, 물을 가하여 일정량으로 하여, 여과 또는 원심분리하여 상등액을 얻고 이에 물을 가하여 적당히 희석하여 용액 1 mL 중에 콜린 약 5 μg을 함유하도록 조제한다.

라. 시험방법

200 mL의 삼각플라스크각 2개씩에 콜린 표준용액 0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 및 5.0 mL를 넣고 각 플라스크에 기초배지 10 mL 및 물을 가하여 20 mL로 하여 표준용액계열로 한다. 별도로 200 mL의 삼각플라스크 각 2개씩에 시험용액 2.0, 3.0 및 4.0 mL를 가하여, 각 플라스크에 기초배지 10 mL 및 물을 가하여 20 mL로 하여 시험용액으로 한다. 각 계열의 플라스크 내용액을 잘 혼화하여, 뚜껑 또는 작은 비커를 덮은 후, 1 kg/cm2로 5분간 가압멸균하여, 냉각 후 각 플라스크에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하고 30℃로 3일간 배양기에서 배양한다.

배양후에는 균의 증식을 멈추게 하기 위해서, 100℃에서 5분간 가열한다. 균의 증식도를 측정하기 위해서, 각 플라스크로부터 균사체를 미리 90℃에서 2시간 건조한 여과지로 여과하여 가능한 한 수분을 제거하여, 90℃로 2시간 건조한 후 건조균사체의 중량을 측정한다.

마. 계산방법

얻어진 값에 환산계수 0.868을 곱하여 콜린의 함량을 구한다.