3.2.1 사카린나트륨

가. 박층크로마토그래프에 의한 정성

1) 분석원리

식품 중의 사카린나트륨을 물로 추출한 후, 용매추출 등을 통하여 정제하고 농축한 다음 박층크로마토그래프로 정성분석하는 방법이다.

2) 장치

가) 폴리아미드 또는 실리카겔 박층

폴리아마이드 또는 실리카겔G(박층크로마토그래프용)에 이소프로판올 또는 물을 가하여 잘 섞어서 호상(풀모양)으로 하여 일반적인 방법에 따라 0.25 ㎜의 박층을 만들고이를 바람에 말린 다음 60～70℃(실리카겔은 110℃)에서 30분간 건조하여 사용한다.

나) 전개조

3) 시약 및 시액

가) 사카린나트륨 표준용액：사카린나트륨 100 mg을 물 25 mL에 녹인 후 에탄올을 가하여 50 mL로 한다.

나) 전개용매

(1) 헥산․초산에틸․개미산 (5：10：5)

(2) 헥산․초산에틸․개미산 (10：7：3)

(3) n-부탄올․암모니아수 (9：1)

(4) 초산에틸

4) 시험용액의 조제

가) 액상검체：검체 20 g을 취하고 물을 가하여 30 mL로 한 다음 분액깔때기에 옮긴다. 다만, 탄산 또는 알콜을 함유한 것은 수욕상에서 가온하여 날려보내고 분액깔때기에 옮긴 다음 물을 가하여 약 50 mL로 한다. ★ 이 액에 10% 염산을 가하여 산성으로 한 다음 초산에틸 50 mL씩으로 2회 추출한다. 추출액을 합하여 포화염화나트륨용액 10 mL씩으로 2회 씻은 다음 무수황산나트륨을 가해 탈수하고 감압농축하여 잔류물을 에탄올 0.5〜1 mL에 녹여 시험용액으로 한다.

나) 반유동상 또는 고체검체 : 검체 20 g을 취하여 균질화한 후 물 50 mL를 가한 다음 삼각플라스크에 옮기고 끓는 수욕상에서 5분간 가열한다. 식힌 후 분액깔때기에 옮기고 가) 액상검체 ★ 이하의 조작에 따라 추출한다.

다) 유지를 함유한 검체：검체 20 g을 분액깔때기에 넣고 헥산 50 mL 및 1% 수산화나트륨용액을 가하여 약알카리성으로 한 물 100 mL를 가하여 진탕혼합한 후 정치하여 하층을 다른 분액깔때기에 옮긴다. 이액을 가) 액상검체 ★ 이하의 조작에 따라 추출한다.

5) 시험방법

폴리아미드 또는 실리카겔 박층의 하단부터에서 2 cm 일직선상에 표준용액 및 시험용액을 1～30 μL씩을 찍고 말린다. 폴리아미드 박층에서는 전개용매 (1)을 이용하여 전개한 후 0℃에서 30분간 말리고, 실리카겔 박층에서는 전개용매 (2), (3) 또는 (4)를 이용하여 전개한 후 100℃에서 20분간 말린 다음 자외선(253.6 nm)조사하에서 관찰하면 표준용액과 동일한 위치에 형광의 반점이 나타난다.

나. 액체크로마토그래프에 의한 정성 및 정량

1) 분석원리

식품 중의 사카린나트륨을 물로 추출한 후 여과하거나 여과액을 역상계 및 강음이온교환형 카트리지로 정제한 다음 액체크로마토그래프로 정성 및 정량분석하는 방법이다.

2) 장치

가) 정제용 카트리지

(1) 역상계 카트리지：Sep-pak C18 또는 이와 동등한 것(사용전에 메탄올 5 mL 및 물 5 mL를 차례로 흘려 보낸 후 사용한다).

(2) 강음이온교환형 카트리지：Sep-pak QMA 또는 이와 동등한 것(사용전에 메탄올 5 mL 및 물 5 mL를 차례로 흘려 보낸 후 사용한다).

3) 시약 및 시액

가) 표준용액：사카린나트륨을 120에서 4시간 건조시킨 후 100 mg을 정밀히 달아 물에 녹여 100 mL로 한다. 사용시 이 용액 1～10 mL를 취하고 물을 가하여 100 mL로 한 것을 표준용액으로 한다.

나) 카레스(Carrez)침전제 : 제1액 15% 페로시안화칼륨용액, 제2액 30% 황산아연용액

4) 시험용액의 조제

가) 액상검체

검체 약 5 g을 취하고 물을 가해 50 mL로 하여 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과한 액을 시험용액으로 한다. 다만, 탄산가스가 있는 경우에는 10분간 초음파 처리하여 탄산가스를 제거하며 알코올을 함유한 경우는 70℃의 수욕상에서 15분간 가온하여 알코올을 증발시켜 검체를 취한다.

나) 고체 또는 반고체검체

검체를 미리 균질화하거나 잘게 썰어 잘 섞은 후 약 2～5 g을 취하여 물 10～20 mL를 가한 다음 10～20분간 흔들어 완전히 용해시키거나 10분간 초음파 추출한다. 이 액에 물을 가해 50 mL로 하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 다음 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과한 액을 시험용액으로 한다.

다) 단백질 함량이 많은 검체

검체를 미리 균질화하거나 잘게 썰어 잘 섞은 후 약 2～5 g을 취하여 물 10～20 mL를 가한다. 이 액에 카레스(Carrez) 침전제 제1액 2 mL를 가해 흔들어 섞은 다음 다시 카레스(Carrez) 침전제 제2액 2 mL를 가해 2분간 흔들어 섞는다. 발생한 거품은 초음파 처리하여 제거한 후 물을 가해 50 mL로 하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 다음 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과한 액을 시험용액으로 한다.

라) 지방 함량이 많은 검체

검체를 미리 균질화하거나 잘게 썰어 잘 섞은 후 약 2～5 g을 취하여 물 10～20 mL를 가한 다음 10～20분간 흔들어 완전히 용해시키거나 10분간 초음파 추출한다. 이 액에 물을 가해 50 mL로 하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 분액깔때기에 옮겨 디에틸에테르 50 mL를 가한 다음 흔들어 정치하고 물층을 취한다. 이 조작을 2회 반복하여 지방성분을 제거한 다음 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과한 액을 시험용액으로 한다. 다만, 상기 가)～라)의 조작후에도 정제가 필요한 경우는 마) 정제에 따라 시험한다.

마) 정제

여과한 액 5 mL를 역상계 카트리지에 분당 3～4 mL의 속도로 떨어뜨리고 물 10 mL로 세척한 후 메탄올：물 (40：60) 혼합액 10 mL로 용출시킨다. 용출액 전량을 강음이온교환형 카트리지에 분당 3～4 mL의 속도로 떨어뜨리고 0.1% 인산 5 mL와 물 5 mL를 사용하여 세척한 후 0.3 N 염산 5 mL로 용출시킨 액을 시험용액으로 한다.

5) 시험방법

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 검출기 : 자외선흡광검출기(UV photometric detector), 210 nm

(2) 칼럼：Nova-Pak C18 또는 이와 동등한 것

(3) 이동상：10% TPA-OH(Tetrapropylammonium hydroxide) 20.3 mL를 메탄올：물(30：70)의 혼합액 약 900 mL에 녹이고 인산으로 pH를 4.0으로 조정한 다음 메탄올：물(30：70) 혼합액으로 전량을 1,000 mL로 한다.

(4) 이동상유량：1.0 mL/min

(5) 주입량 : 10～20 μL

6) 정성시험

시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 크로마토그램상의 사카린나트륨의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액과 시험용액의 머무름 시간(retention time)이 일치하여야 한다.

7) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로부터 작성한 검량선을 이용하여 시험용액 중의 사카린나트륨의 함량을 산출한다.