3.4.1 타르색소(산성색소)

가. 모사염색법에 의한 분리․정성법

1) 시험법 적용범위

과자류, 빵 또는 떡류, 잼류, 식육가공품 또는 알가공품, 어육가공품, 두부류 또는 묵류, 면류, 다류, 음료류, 장류 등 식품에 적용한다.

2) 분석원리

식품 중의 타르색소를 추출하여 초산용액에서 양모에 색소를 착색시킨 후, 세척한 다음 양모에 착색된 색소를 암모니아수로 용출시킨 액을 시험용액으로 하여 여지크로마토그래프, 박층크로마토그래프 등으로 정성분석하는 방법이다.

3) 장치

가) 폴리아미드 또는 실리카겔(5% 황산칼슘을 함유한 것) 박층

폴리아미드 또는 실리카겔G(박층크로마토그래프용)에 이소프로판올 또는 물을 가하여 잘 섞어서 호상(풀모양)으로 하여 일반적인 방법에 따라 0.25 mm의 박층을 만들고 이를 바람에 말린 다음 60～70℃(실리카겔은 110℃)에서 30분간 건조하여 사용한다.

나) 여지(거름종이) : 여지크로마토그래프용

다) 전개조

4) 시약 및 시액

가) 탈지양모

Ⓐ 법：백색양모 100 g을 강암모니아수 1～4 mL를 적당히 물로 희석한 용액 중에 담그고 가끔 저으면서 45℃에서 30～60분간 방치한 다음 건져내어 가볍게 짜고 다음에 희석한 암모니아수(1→100)에 잠시 방치하였다가 건져내어 처음에는 온탕, 다음에는 냉수로 씻고 가볍게 짜서 바람에 말린다.

Ⓑ 법：속슬렛추출장치에서 석유 에테르로 백색양모를 충분히 탈지한 다음 에테르를 실온에서 증발시켜 물로 충분히 씻고 가볍게 짜서 바람에 말린다.

나) 전개용매

(1) 여지크로마토그래프

(가) 아세톤：이소아밀알코올：물(6：5：5)

(나) n-부탄올 : 무수에탄올：1% 암모니아수(6：2：3)

(다) 25% 에탄올용액：5% 암모니아수(1：1)

(2) 박층크로마토그래프(실리카겔 박층)

(가) 초산에틸：메탄올：28% 암모니아수(4.5：1：1 또는 3：1：1)

(나) 아밀알코올(amyl alcohol)：에탄올：28% 암모니아수(10：10：1)

(다) 메틸에틸케톤：에틸렌글리콜모노메틸에테르：에탄올：28% 암모니아수(20：15：12：1)

(3) 박층크로마토그래프(폴리아미드 박층)

(가) 메탄올：에탄올：이소아밀알코올：28% 암모니아수(15：10：5：3)

(나) 피리딘：메탄올：28% 암모니아수：물(5：6：1：16)

(4) 실리카겔(5% 황산칼슘을 함유한 것) 또는 폴리아마이드

폴리아마이드 또는 실리카겔G(박층크로마토그래프용)에 이소프로판올 또는 물을 가하여 잘 섞어서 호상(풀모양)으로 하여 일반적인 방법에 따라 0.25 ㎜의 박층을 만들고 이를 바람에 말린 다음 60～70℃(실리카겔은 110℃)에서 30분간 건조하여 사용한다.

5) 시험용액의 조제

가) 추출：다음의 한 방법에 따라 색소추출액을 만든다.

(1) 액상검체(알코올음료, 음료류, 액체조미료 등)

착색의 정도에 따라 검체 20～200 mL를 취하여 적당히 물을 가하여 시험용액으로 한다. 알코올을 함유한 것은 중화한 다음 수욕상에서 알코올을 증발시키고 물을 보충하여 색소추출액으로 한다.

(2) 농산식품

착색의 정도에 따라 검체 20～200 g을 취하여 가능한 한 작게 부수고 다음의 한 방법에 따라 색소추출액을 만든다.

(가) 엿, 과자, 사탕류

검체에 약 5배량의 온탕을 가하여 잘 저어 녹여 색소추출액으로 한다.

(나) 쨈, 된장, 팥고물 등

검체에 약 3～5배량의 온탕을 가하여 잘 저은 다음 잠시 두었다가 유리솜 또는 석면으로 여과하든가 원심분리하여 고형물을 제거하여 색소추출액으로 한다. 이 방법으로 색소가 추출되지 않을 때에는 (다)에 따라 만든다.

(다) 저장과실 및 야채(앵두, 완두, 단무지 등)

검체에 80%(v/v) 에탄올을 약 4～5배량 가하여 가끔 흔들어 섞으면서 2～3시간 방치하고 상등액을 취하여 약 1% 암모니아수를 함유한 70v/v% 에탄올로 되풀이 하여 추출한다. 상등액은 앞의 상등액에 합치고 6% 초산으로 중화한 다음 끓여 에탄올을 증발시키고 물을 가하여 색소추출액으로 한다. 검체가 아직 현저하게 착색되어 있을 때에는 1% 초산을 함유한 70v/v% 에탄올로 되풀이하여 추출하여 상등액을 취하여 10% 암모니아수로 중화하고 끓여 에탄올을 증발시키고 물을 가하여 색소추출액으로 한다.

(라) 초콜릿 등

검체를 큰 여과지나 비커에 취하여 에테르로 몇번 씻어 탈지하고 에테르를 실온에서 날려보낸 다음 앞의 (나), (다)에 따른다.

(마) 곡류 및 곡류제품

검체에 80%(v/v) 에탄올을 약 5배 가량 가하여 가끔 흔들어 섞으면서 24시간 방치하고 상등액을 취하여 수욕상에서 1/5로 농축하고 약 1/4용량의 25% 염화나트륨용액과 약간 과량의 10%암모니아수를 가하여 분액깔때기에 옮겨 같은 양의 석유에테르로 몇번 탈지한 다음 아래층의 알칼리액을 6% 초산으로 중화하여 색소추출액으로 한다.

(바) 껌 등

검체에 약 5배 가량의 물을 가하여 끓이고 물층이 착색하면 식힌 다음 수용액을 취하여 색소추출액으로 한다.

(사) 수산 및 축산식품(햄, 소세이지, 연제품 등)

검체를 착색의 정도에 따라 20～200 g을 취하여 앞의 (라)에 따른다.

(3) 식육가공품(햄, 소시지 등)

검사시료를 착색의 정도에 따라 20～200 g을 취하여, 검사시료를 큰 여과지나 비커에 취하여 에테르로 몇 번 씻어 탈지하고 에테르를 실온에서 날려 보낸 다음, 검사시료에 약 3～5배량의 온탕을 가하여 잘 저은 다음 잠시 두었다가 유리솜 또는 석면으로 여과하든가 원심분리하여 고형물을 제거하여 색소 추출액으로 한다. 이 방법으로 색소가 추출되지 않을 때에는, 검사시료에 80 v/v% 에탄올을 약 4～5배량 가하여 가끔 흔들어 섞으면서 2～3시간 방치하고 상징액을 취하여 약 1% 암모니아수를 함유한 70 v/v% 에탄올로 되풀이하여 추출한다. 상징액은 앞의 상징액에 합치고 6% 초산으로 중화한 다음 끓여 에탄올을 증발시키고 물을 가하여 색소추출액으로 한다. 검사시료가 아직 현저하게 착색되어 있을 때에는 1% 초산을 함유한 70 v/v% 에탄올로 되풀이 하여 추출하여 상징액을 취하여 10% 암모니아수로 중화하고 끓여 에탄올을 증발시키고 물을 가하여 색소추출액으로 한다.

나) 정제

색소추출액 5 mL에 1% 초산 1 mL를 가하고 탈지양모 0.1 g을 넣고 잘 흔들어 섞은 다음 수욕중에서 30분간 가온한 다음 양모를 건져내어, 양모가 염색되지 않으면 불검출로 하고, 양모가 염색되면 이 염색된 양모를 1% 암모니아용액 5 mL 중에 넣고 30분간 가온한 다음 양모를 건져내고 초산으로 중화하고 약 1%의 농도로 조제하여 시험용액으로 한다.

6) 시험방법

가) 여지크로마토그래프

크로마토그래프용 여과지의 끝에서 40 mm의 곳에 연필로 줄을 긋고 그 위에 시험용액과 색소표준용액을 각각 20 mm의 간격으로 미량 피펫 또는 모세관으로 직경 약 5 mm의 원이 되게 찍고 말린다. 이 여과지를 규정의 전개용매를 넣은 용기에 여과지가 기벽에 닿지 않도록 주의하여 수직으로 매달고 하단 약 10 mm를 전개용매 중에 담그고 뚜껑을 닫아 방치한다. 용매가 반점에서 13～25 cm의 높이까지 상승하였을 때 여과지를 건져내어 말린 다음, 시험용액과 색소표준용액으로부터 전개된 반점의 위치와 색을 처음에 자연광, 다음에 및 자외선(약 365 nm) 조사하에서 비교 관찰한다.

나) 박층크로마토그래프

실리카겔 또는 폴리아미드 박층의 하단에서 2 cm의 일직선상에 시험용액 및 색소표준용액을 직경 약 3 mm로 1 cm의 간격으로 찍고 말린다. 이를 박층의 하단 0.5～1 cm를 전개용매에 담그고 8～15 cm 전개시킨다. 전개가 끝나면 시험용액과 색소표준용액에서 얻은 반점의 위치와 색을 자연광 및 자외선(약 365 nm) 조사하에서 비교 관찰한다.

나. 액체크로마토그래프에 의한 정성 및 정량

1) 시험법 적용범위

과자류, 초콜릿류, 음료류 등 식품에 적용한다.

2) 분석원리

식품 중의 타르색소를 4% 메탄올성 암모니아 용액으로 추출한 후 얻은 상층액을 감압건고시킨 다음 10 mM 아세트산암모늄 용액을 가하여 녹인 후 액체크로마토그래프로 정성 및 정량 분석하는 방법이다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프 : 광다이오드배열 검출기(PDA detector)를 사용한다.

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 타르색소 표준원액 : 타르색소 9종(식용색소녹색제3호, 식용색소적색제2호, 식용색소적색제3호, 식용색소적색제102호, 식용색소적색제40호, 식용색소청색제1호, 식용색소청색제2호, 식용색소황색제4호, 식용색소황색제5호)의 표준품을 각각 물에 녹여 1,000 mg/L이 되도록 한다.

다) 타르색소 표준용액 : 타르색소 표준원액을 10 mM 아세트산암모늄 용액으로 각각 1, 5, 10, 15, 25 μg/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

라) 4% 메탄올성 암모니아 용액 : 암모니아수(밀도 0.880) 4 mL에 메탄올을 가하여 100 mL로 한다.

마) 암모니아수(28〜30%)

바) α-아밀라아제(α-amylase) : ANKOM Technology사 FAA 제품 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 비지방성 식품

(1) 액상 식품(음료류, 주류, 시럽류 등)

시료의 pH가 6〜7인 경우 초음파를 이용하여 가스를 제거한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 시료가 pH 6이하인 경우 시료를 적당량 취한 후 적당량의 10 mM 아세트산암모늄 용액을 가하고 4% 메탄올성 암모니아 용액으로 pH 6〜7로 조정한 후 초음파를 이용하여 가스를 제거한 다음 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 주류 및 시럽류의 경우 적당량의 10 mM 아세트산암모늄 용액을 가하고 4% 메탄올성 암모니아 용액으로 pH 6〜7로 조정한 후 초음파를 이용하여 가스를 제거한 다음 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다. pH 7 이상인 경우는 1N 염산 용액을 가하여 pH 6〜7로 조정한 후 초음파를 이용하여 가스를 제거한 다음 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

(2) 기타식품(과자, 캔디류, 빵류, 잼류 등)

시료(2〜20 g)를 취하고 10배의 4% 메탄올성 암모니아 용액을 가한 후 균질화기(homogenizer)로 1분간 균질화한다. 원심분리 후 상층액을 회수하고, 침전물에 4% 메탄올성 암모니아 용액 15 mL을 첨가하여 흔들어준 후 원심분리하여 상층액을 회수한다. 잔여 색소가 침전물에 남아있는 경우 뜨거운 물 5 mL를 가한 후 잘 혼합한 다음 10 mL의 4% 메탄올성 암모니아 용액을 가하고 원심분리하여 상층액을 회수한다(젤리, 캔디 등 균질화가 어려운 시료의 경우, 4% 메탄올성 암모니아 용액과 뜨거운 물의 순서를 바꿔서 사용할 수 있다). 색소가 잔존하지 않을 때까지 위의 과정을 반복한다. 회수한 색소 추출액을 감압 건고한다. 잔류물을 10 mM 아세트산암모늄 용액을 가하여 잘 녹인 다음 최종 부피가 10 mL가 되도록 한 후 필요시 적당히 희석하여 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

(3) 캡슐형 식품(젤라틴 함유)

시료 2 g을 정밀히 달아 10 mM 아세트산암모늄 용액 27 mL를 가하여 혼합한다. 여기에 α-아밀라아제 1 mL를 넣어 섞어주고 40℃ 항온기에서 30분 간 반응시킨 후 충분히 혼합하여 70℃ 수욕상에서 30분간 반응시킨다. 상온으로 식히고 석유에테르 20 mL를 넣어 잘 섞고 3,000 rpm, 5분간 원심분리한 후 상등액을 따라 버리고 이 과정을 1회 반복한다. 수층을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

나) 지방성 식품(초콜릿류, 코코아가공품류, 식육가공품, 어육가공품 등)

시료(2〜20 g)를 취하고 10배의 4% 메탄올성 암모니아 용액을 가한 후 균질화기(homogenizer)로 1분간 균질화한다. 석유에테르 50 mL를 가하여 1분간 잘 흔들어 섞은 후 정치하여 층을 분리시킨 후 용매층(상층)을 따라 버린다. 이 과정을 3회 반복하여 탈지한다. 원심분리 후 상층액을 회수하고, 침전물에 4% 메탄올성 암모니아 용액 15 mL을 가하여 잘 흔들어준 후 원심분리하여 상층액을 회수한다. 색소가 침전물에 남아 있는 경우 약 100℃ 물 5 mL를 넣고 격렬히 섞어준 후 10 mL의 4% 메탄올성 암모니아 용액을 가하여 잘 흔들어 원심분리한 후 상층액을 회수한다. 색소가 잔존하지 않을 때까지 위의 과정을 반복한다. 회수한 색소 추출액을 감압 건고한다. 잔류물을 10 mM 아세트산암모늄 용액을 가하여 잘 녹인 다음 최종 부피가 10 mL가 되도록 한 후 필요시 적당히 희석하여 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A : 10 mM 아세트산암모늄 용액

(나) 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
00:00	95	5
00:01	95	5
20:00	50	50
20:01	95	5
30:00	95	5

(3) 검출파장 : 황색4호 420 nm,

황색5호, 적색2호, 적색3호, 적색40호, 적색102호 520nm,

청색1호, 청색2호, 녹색3호 620 nm

(4) 유속 : 1.0 mL/분

(5) 주입량 : 10 μL

나) 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

다) 정성시험

시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액과 시험용액의 머무름시간이 일치하여야 한다.

라) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 표준용액의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 이용하여 시험용액 중의 타르색소 농도(μg/mL)를 구하고, 시료 중의 타르색소의 함량(g/kg)을 산출한다.