4.8.2 정량시험

가. 최확수법

1) 제1법

4.3 제조법에 따른 연속한 3단계 이상의 희석시료(10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001)를 각각 5개 또는 3개의 EC 배지(배지 10) 발효관에 접종한 다음 44.±1℃에서 24±2시간 배양한다. 단, 10 mL를 접종할 때에는 2배 농도 EC 배지를 사용하고 0.1 mL 이하를 접종할 필요가 있을 때에는 10배 희석단계액을 각각 1 mL씩 사용한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 가스발생을 인정한 발효관을 대장균(E. coli) 양성이라고 판정하고 별표 1 또는 별표 2 최확수표에 따라 검체 1 mL 또는 1 g 중의 대장균수를 산출한다.

2) 제2법

(1) 시험용액의 제조
패각을 제거한 검체 200 g에 0.1% peptone solution(시액 9) 200mL을 첨가하여 마쇄한 후 마쇄액 20 mL과 동일한 희석액(시액 9) 80 mL을 혼합하여 최종 10배 희석한 것을 시험용액으로 사용한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 시험용액은 필요에 따라 100배, 1,000배 등으로 희석하여 사용할 수 있다.

(2) 추정시험
제조법에 따른 시험용액 10 mL을 5개의 2배 농도 MMGM 배지(배지 72)가 들어있는 시험관에 접종하고, 또 시험용액 1 mL 및 0.1 mL을 각각 5개의 MMGM 배지가 들어있는 시험관에 접종하여 37±1℃에서 24±2시간 배양한다. 배양 결과 시험관내의 배지의 색깔이 노란색으로 되었을 때 추정시험 양성으로 하며 확정시험을 실시한다.

(3) 확정시험
추정시험에서 양성으로 확인된 MMGM 시험관 배양액을 BCIG 한천배지(배지 73)에 분리 배양한다. 44±1℃에서 24±2시간 배양 후 청녹색의(blue-green) 전형적인 집락이 발생되면 대장균( E. coli ) 양성이라고 판정하고 별표 1 최확수표에 따라 검체 100 g중의 대장균수를 산출한다.

3) 유가공품·식육가공품·알가공품

가) 최확수법

최확수법(3개 또는 5개 시험관을 이용한 MPN법)으로 대장균군수 검사에서 사용한 BGLB배지에서 가스생성 양성인 시험관으로부터 EC-MUG배지(또는 BGLB-MUG, LST-MUG)에 접종하여 44±1℃에서 24±2시간 배양한 후 자외선 조사하에 푸른 형광이 관찰되는 시험관을 대장균 양성으로 판정하고 최확수표 (별표 1 또는 별표 2)에 근거하여 대장균수를 산출한다.

나) 대장균 확인시험

최확수법에서 가스생성과 형광이 관찰된 것은 대장균 추정시험 양성으로 판정하고 대장균의 확인시험은 추정시험 양성으로 판정된 시험관으로부터 EMB배지(또는 MacConkey Agar)에 이식하여 37℃에서 24시간 배양하여 전형적인 집락을 관찰하고 그람염색, MUG시험, IMViC시험, 유당으로부터 가스 생성시험 등을 검사하여 최종확인한다. 대장균은 MUG시험에서 형광이 관찰되며, 가스생성, 그람음성의 무아포간균이며, IMViC시험에서 “ + + - - ”의 결과를 나타내는 것은 대장균(E. coli) biotype 1로 규정한다.

나. 건조필름법

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 단계 희석액 1 mL를 2매 이상씩 대장균 건조필름배지Ⅰ(배지 55) 또는 대장균 건조필름배지Ⅱ(배지 71)에 접종한 후, 35±1℃에서 24∼48시간 배양한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 대장균 건조필름배지Ⅰ에서는 푸른 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하고, 대장균 건조필름배지Ⅱ에서는 남색 및 보라색의 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균 수를 산출한다. 균수 산출 및 기재보고는 4.5.1 일반세균수에 따라 한다.

다. 자동화된 최확수법(Automated MPN)

자연치즈, 식육추출가공품, 닭도체, 오리도체에 한한다.

별표 1. 3단계희석 시험관 5개씩 시험하였을 때 양성에 대한 최확수(95%의 신뢰한계)

양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)
0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0 4 0 0 4 1 0 4 2 0 4 3 0 4 4 0 4 5 0 5 0 0 5 1 0 5 2 0 5 3 0 5 4 0 5 5	<1.8 1.8 3.6 5.4 7.2 9 1.8 3.6 5.5 7.3 9.1 11 3.7 5.5 7.4 9.2 11 13 5.6 7.4 9.3 11 13 15 7.5 9.4 11 13 15 17 9.5 11 13 15 17 19	1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 5 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1 4 1 1 5 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 2 4 1 2 5 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3 1 3 4 1 3 5 1 4 0 1 4 1 1 4 2 1 4 3 1 4 4 1 4 5 1 5 0 1 5 1 1 5 2 1 5 3 1 5 4 1 5 5	2 4 6 8 10 12 4 6.1 8.1 10 12 14 6.1 8.2 10 12 15 17 8.3 10 13 15 17 19 11 13 15 17 19 22 13 15 17 19 22 24	2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 0 4 2 0 5 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 1 4 2 1 5 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 2 4 2 2 5 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 2 3 4 2 3 5 2 4 0 2 4 1 2 4 2 2 4 3 2 4 4 2 4 5 2 5 0 2 5 1 2 5 2 2 5 3 2 5 4 2 5 5	4.5 6.8 9.1 12 14 16 6.8 9.2 12 14 17 19 9.3 12 14 17 19 22 12 14 17 20 22 25 15 17 20 23 25 28 17 20 23 26 29 32	3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 0 4 3 0 5 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 1 4 3 1 5 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 2 4 3 2 5 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3 3 3 4 3 3 5 3 4 0 3 4 1 3 4 2 3 4 3 3 4 4 3 4 5 3 5 0 3 5 1 3 5 2 3 5 3 3 5 4 3 5 5	7.8 11 13 16 20 23 11 14 17 20 23 27 14 17 20 24 27 31 17 21 24 28 31 35 21 24 28 32 36 40 25 29 32 37 41 45	4 0 0 4 0 1 4 0 2 4 0 3 4 0 4 4 0 5 4 1 0 4 1 1 4 1 2 4 1 3 4 1 4 4 1 5 4 2 0 4 2 1 4 2 2 4 2 3 4 2 4 4 2 5 4 3 0 4 3 1 4 3 2 4 3 3 4 3 4 4 3 5 4 4 0 4 4 1 4 4 2 4 4 3 4 4 4 4 4 5 4 5 0 4 5 1 4 5 2 4 5 3 4 5 4 4 5 5	13 17 21 25 30 36 17 21 26 31 36 42 22 26 32 38 44 50 27 33 39 45 52 59 34 40 47 54 62 69 41 48 56 64 72 81	5 0 0 5 0 1 5 0 2 5 0 3 5 0 4 5 0 5 5 1 0 5 1 1 5 1 2 5 1 3 5 1 4 5 1 5 5 2 0 5 2 1 5 2 2 5 2 3 5 2 4 5 2 5 5 3 0 5 3 1 5 3 2 5 3 3 5 3 4 5 3 5 5 4 0 5 4 1 5 4 2 5 4 3 5 4 4 5 4 5 5 5 0 5 5 1 5 5 2 5 5 3 5 5 4 5 5 5	23 31 43 58 76 95 33 46 63 84 110 130 49 70 94 120 150 180 79 110 140 180 210 250 130 170 220 280 350 430 240 350 540 920 1,600 >1,600

양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL	양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL	양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL	양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL	양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL	양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL
0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0 4 0 0 4 1 0 4 2 0 4 3 0 4 4 0 4 5 0 5 0 0 5 1 0 5 2 0 5 3 0 5 4 0 5 5	<1.8 1.8 3.6 5.4 7.2 9 1.8 3.6 5.5 7.3 9.1 11 3.7 5.5 7.4 9.2 11 13 5.6 7.4 9.3 11 13 15 7.5 9.4 11 13 15 17 9.5 11 13 15 17 19	1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 5 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1 4 1 1 5 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 2 4 1 2 5 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3 1 3 4 1 3 5 1 4 0 1 4 1 1 4 2 1 4 3 1 4 4 1 4 5 1 5 0 1 5 1 1 5 2 1 5 3 1 5 4 1 5 5	2 4 6 8 10 12 4 6.1 8.1 10 12 14 6.1 8.2 10 12 15 17 8.3 10 13 15 17 19 11 13 15 17 19 22 13 15 17 19 22 24	2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 0 4 2 0 5 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 1 4 2 1 5 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 2 4 2 2 5 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 2 3 4 2 3 5 2 4 0 2 4 1 2 4 2 2 4 3 2 4 4 2 4 5 2 5 0 2 5 1 2 5 2 2 5 3 2 5 4 2 5 5	4.5 6.8 9.1 12 14 16 6.8 9.2 12 14 17 19 9.3 12 14 17 19 22 12 14 17 20 22 25 15 17 20 23 25 28 17 20 23 26 29 32	3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 0 4 3 0 5 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 1 4 3 1 5 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 2 4 3 2 5 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3 3 3 4 3 3 5 3 4 0 3 4 1 3 4 2 3 4 3 3 4 4 3 4 5 3 5 0 3 5 1 3 5 2 3 5 3 3 5 4 3 5 5	7.8 11 13 16 20 23 11 14 17 20 23 27 14 17 20 24 27 31 17 21 24 28 31 35 21 24 28 32 36 40 25 29 32 37 41 45	4 0 0 4 0 1 4 0 2 4 0 3 4 0 4 4 0 5 4 1 0 4 1 1 4 1 2 4 1 3 4 1 4 4 1 5 4 2 0 4 2 1 4 2 2 4 2 3 4 2 4 4 2 5 4 3 0 4 3 1 4 3 2 4 3 3 4 3 4 4 3 5 4 4 0 4 4 1 4 4 2 4 4 3 4 4 4 4 4 5 4 5 0 4 5 1 4 5 2 4 5 3 4 5 4 4 5 5	13 17 21 25 30 36 17 21 26 31 36 42 22 26 32 38 44 50 27 33 39 45 52 59 34 40 47 54 62 69 41 48 56 64 72 81	5 0 0 5 0 1 5 0 2 5 0 3 5 0 4 5 0 5 5 1 0 5 1 1 5 1 2 5 1 3 5 1 4 5 1 5 5 2 0 5 2 1 5 2 2 5 2 3 5 2 4 5 2 5 5 3 0 5 3 1 5 3 2 5 3 3 5 3 4 5 3 5 5 4 0 5 4 1 5 4 2 5 4 3 5 4 4 5 4 5 5 5 0 5 5 1 5 5 2 5 5 3 5 5 4 5 5 5	23 31 43 58 76 95 33 46 63 84 110 130 49 70 94 120 150 180 79 110 140 180 210 250 130 170 220 280 350 430 240 350 540 920 1,600 >1,600

※ 최확수법을 이용한 판정 시 양성 시험관수가 모두 0인 경우 결과값은 0으로 간주한다.

별표 2. 3단계희석 시험관 3개씩 시험하였을 때 양성에 대한 최확수(95%의 신뢰한계)

양성시험관수	MPN/g(mL)	양성시험관수	MPN/g(mL)
0.1 0.01 0.001		0.1 0.01 0.001
0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3	<3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.4 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29	2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3	9.2 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 38 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1,100

양성시험관수	MPN/100(mL)	양성시험관수	MPN/100(mL)
10 1 0.1		10 1 0.1
0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3	<3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.4 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29	2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3	9.2 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 38 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1,100

※ 최확수법을 이용한 판정 시 양성 시험관수가 모두 0인 경우 결과값은 0으로 간주한다.