4.16 장출혈성 대장균

본 시험법은 대장균 O157:H7과 대장균 O157:H7이 아닌 시가독소(동의어: 베로독소) 생성 대장균(STEC, Shiga toxin producingE.coli)을 모두 검출하는 시험법이다. 장출혈성 대장균의 낮은 최소 감염량을 고려하여 검출 민감도 증가와 신속 검사를 위한 스크리닝 목적으로 증균 배양 후 배양액(1～2 mL)에서 시가독소 유전자 확인시험을 우선 실시한다. 시가독소(stx1 그리고/또는 stx2) 유전자가 확인되지 않을 경우 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 시가독소 유전자가 확인된 경우에는 반드시 순수 분리하여 분리된 균의 시가독소 유전자 보유 유무를 재확인한다. 시가독소가 확인된 집락에 대하여 생화학적 검사 등을 통하여 대장균으로 동정된 경우 장출혈성대장균으로 판정한다.

가. 증균배양

검체 25g(25mL)을 취하여 225mL mTSB(배지 74)를 가한 후 35～37℃에서 24시간 증균배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 mTSB를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 분리배양

장출혈성대장균의 분리를 위해 TC-SMAC 배지(배지 66)와 BCIG 한천배지(배지 73)에 각각 접종하여 35～37℃에서 18～24시간 배양한다.

다. 확인시험

TC-SMAC배지에서는 sorbitol을 분해하지 않은 무색집락을, BCIG 한천배지에서는 청록색 집락 각 5개 이상을 취하여 보통한천배지에 옮겨 35～37℃에서 18～24시간 배양한다. 전형적인 집락이 5개 이하일 경우 취할 수 있는 모든 집락에 대하여 확인시험을 실시한다. 배양 후 집락에 대하여 다음의 시가독소 유전자 확인 시험을 수행한 후 시가독소 양성 집락을 대상으로 그람음성간균을 확인하고 생화학시험을 실시하여 대장균으로 확인된 경우 장출혈성대장균으로 판정한다.

라. 시가독소 유전자 확인실험

시가독소 유전자는 다음의 PCR법 또는 Real-time PCR법에 따라 실시한다.

1) PCR 법

(1) 주형유전자 준비

전형적인 집락을 취하여 멸균증류수 100 μL에 현탁한 후, 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

유전자	염기서열(5‘→3’)	결과확인
stx1	(F)ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC (R)AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC	180 bp
stx2	(F)GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC (R)TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT G	255 bp

(2) PCR 프라이머 염기서열

(3) PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
완충액	1×	10×	5μL
MgCl2	1.2 mM	12 mM	5μL
dNTPs	0.2 mM	2.5 mM	4μL
stx1프라이머(F)	50 pmol/tube	50 pmol/μL	1μL
stx2프라이머(R)	50 pmol/tube	50 pmol/μL	1μL
stx1프라이머(F)	50 pmol/tube	50 pmol/μL	1μL
stx2프라이머(R)	50 pmol/tube	50 pmol/μL	1μL
주형 DNA	25～50 ng 또는 10μL	-	10μL
Taq	2.5 U/tube	5 U/μL	0.5μL
증류수	-	-	21.5μL
총량	-	-	50μL

반응 단계	구분	온도	시간	반응회수
1	변성(denaturation)	95℃	60초	10회
	결합(annealing)	65℃	120초
	신장(extension)	72℃	90초
2	변성(denaturation)	95℃	60초	5회
	결합(annealing)	64℃→60℃ 1℃/회 감소	120초
	신장(extension)	72℃	90초
3	변성(denaturation)	95℃	60초	10회
	결합(annealing)	60℃	120초
	신장(extension)	72℃	90초
4	변성(denaturation)	95℃	60초	10회
	결합(annealing)	60℃	120초
	신장(extension)	72℃	150초
5	보존(store)	4℃	-	-

(4) PCR 반응조건
PCR 반응은 아래 표의 반응 단계 1∼5까지 순차적으로 실시하되 5단계는 생략할 수 있다. 반응 1단계는 10회 반복으로 결합온도 65℃, 반응 2단계는 5회 반복으로 결합온도 64℃에서 시작하여 반응 회수마다 결합온도를 1℃ 감소시켜 마지막 5회는 결합온도가 60℃이며, 뒤의 반응 3단계는 10회 반복으로 결합온도 60℃로 유지하고, 반응 4단계는 신장 시간을 150초로 늘려 10회 반응시킨다.

※ 위 방법은 ISO의 Shiga toxin-producingEscherichia coli(STEC) PCR 검사법의 일부를 변경하여 사용한 것임

※ 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

(5) 결과 확인
최종산물의 반응액 5 μL를 취하여 2.0% agarose gel로 100V에서 25분간 전기영동하고 에티디움 브로마이드(EtBr)(1 μL/mL) 또는 동등한 기능의 염색시약으로 염색한 후 UV를 이용하여 반응생성물을 확인한다. 이때, DNA 크기를 알 수 있도록 100 bp ladder를 동시에 전기영동 한다. stx1 유전자(180 bp) 또는/그리고 stx2 유전자(255 bp)의 반응생성물이 확인되는 경우 시가독소 유전자가 확인된 것으로 판정한다.

2) Real-time PCR법

(1) 주형 유전자 준비

상기 1) PCR법의 (1) 주형유전자 준비에 따른다.

(2) Real-time PCR 프라이머 염기서열

Target gene	염기서열(5‘→3’)		size (bp)
stx1	Forward	TTT GTY ACT GTS ACA GCW GAA GCY TTA CG	131
	Reverse	CCC CAG TTC ARW GTR AGR TCM ACR TC
	Probe	FAM-CTG GAT GAT CTC AGT GGG CGT TCT TAT GTA A-TAMRA
stx2	Forward	TTT GTY ACT GTS ACA GCW GAA GCY TTA CG	128
	Reverse	CCC CAG TTC ARW GTR AGR TCM ACR TC
	Probe	VIC-TCG TCA GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC-TAMRA

※ 상기 염기서열에서 Y는 (C, T), S는 (C, G), W는 (A, T), R은 (A, G), M은 (A, C)을 뜻한다. Probe의 FAM , VIC 또는 TAMRA 등은 장비에 맞게 선택할 수 있다.

(3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix	1x	2x	10 μL
프라이머 (F)	1 μM	10 pmol/μL	2 μL
프라이머 (R)	1 μM	10 pmol/μL	2 μL
stx1 프로브 (P)	400 nM	20 pmol/μL	0.4 μL
stx2 프로브 (P)	100 nM	5 pmol/μL	0.4 μL
주형 DNA	-	-	2 μL
증류수	-	-	3.2 μL
총량	-	-	20 μL

(4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(initial denaturation)	95℃	10분	-
변성(denaturation)	95℃	10초	40
결합(annealing)	55℃	5초
신장(extension)	72℃	15초

※ 상기 Real-time PCR 반응액 조성 및 조건은 적절하게 변형하여 사용할 수 있다

(5) 결과 확인

증폭곡선이 확인된 경우 시가독소 유전자가 확인된 것으로 판정한다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

마. 장출혈성대장균 중 대장균 O157:H7의 확정이 필요할 경우 분리배양 시 TC-SMAC(배지 66) 배지를 사용하여 sorbitol을 분해하지 않는 무색집락에 대하여 최종적으로 베로독소 보유 및 대장균 동정 확인한다. 양성균주에 대하여 O157과 H7 혈청형의 결정은 제조사가 제시하는 방법에 따라 시험한다. 최종적으로 베로독소 유전자(VT1 또는/그리고 VT2) 양성, O157 및 H7 혈청 확인, 대장균으로 확인되었을 때 O157:H7으로 판정한다.