4.18.1 정성시험

가. 분리배양

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 희석액을 가하여 균질화한 시험용액을 MYP한천배지(배지 46)에 접종하여 30℃, 24시간 배양하거나 PEMBA한천배지(배지 98)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.배양후 MYP한천배지에서는 혼탁한환을 갖는 분홍색 집락 또는PEMBA한천배지에서는 혼탁한환을 갖는 청녹색 집락을 선별한다. 이 때 명확하지 않을 경우 24시간 더 배양하여 관찰한다.

나. 확인시험

각 배지에서 전형적인 집락을 선별하여 보통한천배지(배지 8)에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한다.배양 후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람양성 간균을 확인하고, 확인된 균은 nitrate 환원능, VP, β-hemolysis, tyrosine 분해능, 혐기배양시의 포도당 이용 등의 생화학시험을 실시하며, 추가로 30℃, 24시간 그리고 상온, 2∼3일 추가 배양하여 곤충독소단백질(Insecticidal crystal protein) 생성 확인시험주)도 실시한다.

주) 이 시험법은Bacillus cereus와Bacillus thuringiensis를 구분하는 시험법으로, 보통한천배지에 30℃, 24시간 그리고 상온, 2∼3일 추가 배양한 후 직접 또는 염색하여 현미경 관찰결과(×1000배), 곤충독소단백질이 확인되면Bacillus thuringiensis로 한다.