4.23 결핵균

가. 배양 전 확인법 및 균 배양 후 균 분리검사

우유와 같은 액상의 검체는 그대로 사용하고, 식육 및 식육가공품은 검체 25 g에 희석액 225 mL을 가한 후 유제액을 제조하여 사용한다. 액상 검체 또는 유제액 25 mL를 3,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상층부를 새로운 시험관에 취하고 침전물에서 1 백금이를 취하여 도말표본을 만들고 Ziel-Neelsen법으로 항산성염색을 실시하여 항산성균을 검경으로 확인한다. 상층부에는 동량의 8% NaOH액을, 침전물에는 그의 약 10배량의 4% NaOH액을 가하여 잘 혼합한 후 각각 0.1 mL씩을 Lowenstein-Jensen 사면배지(배지 80) 또는 Middlebrook 7H10 한천배지(배지 81)에 접종한 후 37℃에서8주간 배양한다. 유제액을 제조하여 사용하는 경우에는 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.배양기간 동안 배양유무를 육안으로 관찰한다. 배양이 육안으로 관찰되면 slide glass에 균를 도말하여 Ziehl-Neelsen법으로 항산성염색을 실시하여 항산성균을 검경으로 확인한다. 결핵균의 성장은 일반적으로 3∼6주 배양동안 관찰된다. 특이적으로 느린 성장패턴과 균 모양으로 결핵균을 잠정적으로 진단할 수 있다.

나. 확인검사

1) 생화학적 검사

모든 분리균주는 결핵균 동정을 위해 생화학적 검사(나이아신 생산과 나이트레이트 환원) 또는 특이유전자 동정에 의한 확인이 필요하다. 적절한 피루베이트 고형배지(배지 86, pyruvate-based solid medium)에서 결핵균의 균은 담황색이다. 결핵균은 37℃에서 느리게 성장하며, 22℃ 또는 45℃에서는 성장하지 않는다.

2) PCR 시험 방법

표 1의 primer set와 표 2의 PCR 조건에 따라 PCR을 실시한다. 공통적으로 DNA 농도는 10 ng이상, primer forward 및 reverse는 각각 20 pmol 씩 넣고, 상업적 시약인 20 μL용 또는 50 μL용 PCR premix를 이용하여 PCR을 수행한다.

표 1. 결핵균 PCR용 primer set

Target	Primer sequence		Size
IS6110	Forward	5‘-GGA-CAA-CGC-CGA-ATT-GCG-3'	559 bp
	Reverse	5'-TAG-GCG-TCG-GTG-ACA-AAG-GCC-AC-3'
IS1081	Forward	5'-CTG-CTC-TCG-ACG-TTC-ATC-GCC-G-3'	135 bp
	Reverse	5'-GGC-ACG-GGT-GTC-GAA-ATC-ACG-3'
MPB70	Forward	5'-AAA-GAA-TTC-GGA-CGG-CTC-CGA-AGA-AAT-C-3'	678 bp
	Reverse	5'-CCC-GGA-TCC-TTA-CGC-CGG-AGG-CAT-TAG-CAC-3'
16S- rRNA	Forward	5‘-GTT-CGA-ACG-GGT-GAG-TAA-CAC-GTG-3'	984 bp
	Reverse	5'-TGT-TAA-CAT-CTC-ACG-ACA-CGA-GCT-3'

표 2. PCR 반응 조건

	IS6110		IS1081		MPB70		16s-rRNA
초기변성	95℃, 5분		95℃, 8분		95℃, 5분		94℃, 5분
변성	95℃, 45초	35회	95℃, 10초	45회	95℃, 1분	30회	94℃, 30초	40회
결합	60℃, 45초		58℃, 30초		55℃, 2분		58℃, 30초
신장	72℃, 45초		72℃, 20초		72℃, 1분		72℃, 40초
최종신장	72℃, 10분		72℃, 2분		72℃, 5분		72℃, 5분

※ 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

다. 동물실험

배양하고 남은 시료는 bromthymol blue(0.2%)를 가한 염산수용액을 적하하여 중화시킨 후 1～2 mL씩을 guinea pig의 피내에 접종한다. Guinea pig은 tuberculin 피내반응 음성인 것으로서 체중 300 g 이상인 것을 사용하며 접종 후 2주간부터 가끔 tuberculin 반응과 체중을 조사한다. 결핵균에 감염을 받은 경우에는 보통 2～5주간부터 피내반응 양성으로 나타나고 체중은 점차로 감소하며 접종한 국소에 경결 또는 궤양이 생기며 국소 임파절이 종창한다. 4～8주 후에 guinea pig은 죽고 부검하여 임파절 및 각 장기의 결핵성 변화를 관찰한다. 병변부위의 장기를 무균적으로 채취하여 1% NaOH로 유제를 만들고 그 0.1 mL씩을 Lowenstein-Jensen 사면배지(배지 80) 또는 Middlebrook 7H10 한천배지(배지 81)에 배양하여 다시 결핵균을 확인한다. 결핵균의 항산성염색 방법은 다음과 같다.

(가) 도말표본을 가열하여 고정한다.

(나) Ziehl's carbol fuchsin으로 가열하면서 3분간 염색하고 증류수로 수세한다.

(다) Acid alcohol로 2분간 탈색한 다음 수세한다.

(라) Alkaline brilliant green으로 3분간 염색한 다음 세척한다.

(마) 현미경으로 항산성균을 관찰한다.