7.3.2.1 이사-디(2,4-D), 이사오-티(2,4,5-T)

가. 시험법 적용범위가금류고기, 가금육, 돼지고기, 말고기, 소고기, 알, 유, 양고기, 염소고기, 포유류고기 등 축산물에 적용한다.

나. 분석원리시료를 메탄올로 추출한 후 GPC로 정제, 메틸에스테르화하여 플로리실 컬럼크로마토그래피로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다.

다. 장치

1) 기체크로마토그래프-전자포획검출기(GC-ECD)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 잔류농약 시험용 및 액체크로마토그래프용

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

4) 표준원액 : 2,4-D(2,4-D, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 2,4,5-T(2,4,5-T, 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid)를 각각 아세톤에 녹여 100 mg/L가 되게 한다.

5) 표준용액 : 각 표준원액 적당량을(합하여 약 3 mL 정도 되게) 플라스크에 넣고 이에 1 M-Tetrabutylamonium hydroxide(TBAH)/메탄올 용액 80 μL와 요오드메탄 40 μL를 넣은 후 밀봉한 상태로 40℃에서 1.5 시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 헥산 50 mL를 넣고 약 1 mL가 남을 때까지 증발시킨다. 여기에 물 2 mL를 넣고 잘 섞은 후 층을 분리시켜 물층을 제거한다.

6) GPC 컬럼 : 먼저 500 mL의 비커에 Bio-Beads SX-3(200～400메쉬(mesh)) 35 g을 넣고 디클로로메탄 : 헥산(1 : 1)의 혼합액 150 mL를 사용하여 잘 섞어준 후 직경 25 mm에 5 μm의 Teflon membrane filter로 되어있는 컬럼에 충전시킨다.

마. 시험용액의 조제

1) 추출
시료를 잘게 썰거나 갈은 후 50 g을 달아 물 50 mL, 메탄올 100 mL, 10% 황산 그리고 수산나트륨(또는 수산칼륨) 2 g을 넣고 약 2분간 강하게 흔들어 추출한 후 여과하여 원심분리관에 옮긴다. 원심분리관을 1분간 흔들고 석유에테르 50 mL를 넣은 후 다시 1분간 강하게 흔들어준다. 이것을 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층(용매층)을 물 500 mL, 포화염화나트륨용액 30 mL 및 10% 황산 10 mL를 넣은 분액깔때기에 옮긴다. 원심분리관의 잔류물에 디에틸에테르 및 석유에테르(1 : 1) 혼합액 50 mL로 2회 세척한 후 분액깔때기에 합한다. 여기서 분리한 유기용매층을 물 100 mL, 포화염화나트륨용액 30 mL 그리고 10% 황산 10 mL로 2회 세척하고 유기용매층에 디클로로메탄 50 mL를 넣은 후 스나이더컬럼을 사용하여 용량이 변하지 않을 때 까지 증류한다.

2) 정제 및 유도체화

가) GPC 정제 : 증류하고 남은 액을 여과지로 여과한 후 GPC 컬럼관으로 흘려주고 디클로로메탄 : 헥산(1 : 1) 혼합액 160 mL로 용출하여 받는다. 위의 용출액을 약 3 mL정도 될 때까지 증발시킨 후 아세톤 50 mL를 넣고 약 1 mL로 농축한다.

나) 메틸에스테르화 : 위의 용액에 아세톤을 넣어 30 mL로 만들고 1 M TBAH/메탄올 용액 80 μL와 요오드메탄 40 μL를 넣은 후 밀봉한 상태로 40℃에서 1.5시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 헥산 50 mL를 넣고 약 1 mL가 남을 때까지 증발시킨다. 여기에 물 2 mL를 넣고 잘 섞은 후 층을 분리시켜 물층을 제거한다.

다) 플로리실 정제 : 안지름 10 mm의 컬럼관에 헥산을 사용하여 플로리실 5 g과 무수황산나트륨을 2 cm 높이로 차례로 충전시킨 후 컬럼에 헥산 15 mL를 넣고 유출하여 컬럼을 씻어주고 위의 유도체화한 용액을 넣는다. 이어서 디클로로메탄 : 헥산(2 : 8) 혼합액 35 mL(용출액 1) 그리고 디클로로메탄 : 아세토니트릴 : 헥산(50 : 0.35 : 49.65) 혼합액 60 mL(용출액 2)로 용출하고 각각의 용출액을 따로 받는다. 피크로람(Picloram)의 분석시는 위의 컬럼에 에테르 100 mL(용출액 3)로 추가 용출한다. 각각의 용출액은 40℃ 이하에서 감압 농축하고 용출액 1은 잔류물을 헥산 일정량에 녹여 시험용액으로 한다. 용출액 2와 3은 대부분의 용매를 농축시킨 후 다시 헥산 50 mL를 넣고 재농축하고 잔류물을 헥산 일정량에 녹여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 기체크로마토그래프의 분석조건

가) 컬럼충전제

(1) 고정상담체 : 기체크로마토그래프용 크로모솔브W(HP), 크로모솔브W(AW-DMCS) 및 가스크롬Q(80～100메쉬(mesh)) 또는 이와 동등한 것

(2) 고정상액체 : QF-1, SE-30, OV-275 또는 XE-60을 5%로 입히거나 DEG와 인산을 각각 2%, 0.5%로 입힌 것 또는 이와 동일한 것(7. 식품 중 잔류농약 시험법 7.1.2.1의 바. 시험조작 중 ｢사용이 가능한 동등한 컬럼｣ 참조)

(3) 컬럼 : 안지름 2～3 mm, 길이 100～200 cm의 유리관

(4) 주입부 및 검출기의 온도 : 각각 200～250℃, 250～280℃

(5) 오븐 온도 : 180～220℃사이에서 항온

(6) 이동상가스 및 유속 : 질소(N2) (20～50 mL/분)

2) 검량선의 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 정량한계
0.05 mg/kg

사. 정성시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 분석조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간(retention time)과 일치하여야 한다.

아. 정량시험정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크높이법 또는 피크면적법에 따라 정량한다.주1) 위의 동시시험법에 적용 가능한 농약2,4,6-TBA(용출액 1, 또는 2) 2,4-D(용출액 1, 2), 2,4,5-T(용출액 1, 2), 2,4-DB(용출액 1, 2), 4-CPA(용출액 2), Acifluorfen(용출액 1), Bifenox(용출액 1 또는 2), Bromofenoxim 용출액 2, 표준용액 유도체 안함), Bromoxynil(용출액 2, 표준용액 유도체 안함), Cloprop(용출액 2, 표준용액 유도체 안함), Dicamba(용출액 2), Dichlorprop(용출액 1 또는 2, 표준용액 유도체 안함), Diclofop(용출액 2), DNOC(용출액 2, 표준용액 유도체 안함), Fenac(용출액 1 또는 2, 표준용액 유도체 안함), Fluroxypyr(용출액 3, 표준용액 유도체 안함), Ioxynil(용출액 1 또는 2, 표준용액 유도체 안함), MCPA(용출액 1 또는 2), MCPB(용출액 1 또는 2, 표준용액 유도체 안함), Mecoprop(용출액 1 또는 2, 표준용액 유도체 안함), Pentachlorophenol(용출액 1 또는 2), Picloram(용출액 3), Silvex(용출액 1 또는 2), Triclopyr(용출액 1 또는 2)