8.3.1겐타마이신(Gentamicin), 네오마이신(Neomycin), 디히드로스트렙토마이신(Dihydrostreptomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 아미카신(Amikacin), 아프라마이신(Apramycin), 카나마이신(Kanamycin), 파로모마이신(Paromomycin, aminosidine, monomycin), 하이그로마이신B(Hygromycin B)

1) 시험법 적용범위
축·수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리
시료 중 분석대상 물질을 2% 삼염화초산 함유 10 mM 아세트산암모늄 수용액으로 추출한 후 C 18분말로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매：액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액 : 각각의 표준품을 정밀히 달아 물에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.

라) 혼합표준용액 : 100 mL 용량플라스크에 각 표준원액을 물로 희석하여 10 mg/L가 되게 하고 냉동 보관한다. 혼합표준용액은 물로 희석하여 적당한 농도가 되게 하여 사용한다.

마) 내부표준물질 표준원액 :토브라마이신 표준품을 물에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.

바) 내부표준물질 표준용액: 내부표준물질의 표준원액을 물로 희석하여 200 ng/mL가 되게 한다.

사)  2% 삼염화초산이 함유된 10 mM 아세트산암모늄 수용액 : 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산암모늄 0.77 g을 넣고 물 950 mL로 녹인 후 5 N 염산으로 pH를 4.0으로 맞춘다. 여기에 Na2EDTA·2H2O 0.15 g, 삼염화초산 20 g, NaCl 5 g을 넣고 녹인 후 물로 표시선까지 채운다.

아) 20 mM Heptafluorobutyric acid (HFBA) 함유5% 아세토니트릴 : 1,000 mL 용량플라스크에 아세토니트릴 50 mL와 HFBA 2.6 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

자) 20 mM Heptafluorobutyric acid (HFBA) 함유50% 아세토니트릴 : 1,000 mL 용량플라스크에 아세토니트릴 500 mL와 HFBA 2.6 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

차) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것

카) 기구 : 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

5) 첨가시료의 조제

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 분석대상 시료와 동일 또는 유사한 매질의 음성대조시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후, 가능한 분석하고자 하는 농도가 검량선의 중심에 오게 하여 5～6단계로 조제한다.

6) 시험용액의 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 내부표준물질(토브라마이신, 200 ng/mL)을 200 μL 첨가하여 15분간 정치한다. 2% 삼염화초산을 함유한 10 mM 아세트산암모늄 용액 5 mL를 넣고 20분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 4,800 G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 2 mL 마이크로 원심분리관에 1 mL를 취하여 –20℃에서 20분간 방치한 후 4℃에서 20,000 G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 전량 취하여 C18 분말 100 mg이 들어있는 2 mL 마이크로 원심분리관에 넣고 흔들어 섞어 추출한 후 4℃에서 20,000 G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하고 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 폴리프로필렌 바이알에 담아 시험용액으로 한다.

7) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼 : C18(2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A : 20 mM HFBA 함유 5% 아세토니트릴

(나) 이동상 B : 20 mM HFBA 함유 50% 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	80	20
0.5	80	20
9.0	5	95
10.0	5	95
10.1	80	20
15.0	80	20

(3) 유속 : 0.3 mL/분

(4) 칼럼온도 : 40℃

(5) 주입량 : 10 μL

나) 질량분석기 측정조건

(1) 이온화 : ESI(positive)

(2) Capillary temperature : 400℃

(3) Capillary voltage : 1.2 kV (positive)

(4) Collision gas : 아르곤(Ar)

(5) 분석대상물질의 개별조건

분석성분 (Compound)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온(Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
겐타마이신 C1 (Gentamicin C1)	[M+H]+	477.3	478.3	157.1	20
				160.0	22
				322.2	14
겐타마이신 C1a (Gentamicin C1a)	[M+H]+	449.3	450.3	112.0	26
				160.0	22
				322.2	12
겐타마이신 C2 (Gentamicin C2)	[M+H]+	463.3	464.3	112.0	42
				160.0	20
				322.2	10
겐타마이신 C2a (Gentamicin C2a)	[M+H]+	463.3	464.3	112.0	34
				160.0	20
				322.2	12
네오마이신 (Neomycin)	[M+H]+	614.3	615.2	160.6	32
				163.5	32
				293.1	20
디하이드로 스트렙토마이신 (Dihydrostreptomycin)	[M+H]+	583.3	584.2	221.1	36
				246.1	34
				263.1	28
스트렙토마이신 (Streptomycin)	[M+H]+	581.3	582.3	221.1	38
				246.1	36
				263.1	30
스펙티노마이신 (Spectinomycin)	[M+H2O+H]+	332.2	350.9	189.1	25
				207.1	16
				333.2	22
아미카신 (Amikacin)	[M+H]+	585.3	586.4	163.1	34
				264.2	24
				425.2	12
아프라마이신 (Apramycin)	[M+H]+	539.3	540.3	217.1	26
				344.1	18
				378.2	16
카나마이신 (Kanamycin)	[M+H]+	484.2	485.2	163.0	26
				205.1	32
				324.1	14
파로모마이신 (Paromomycin)	[M+H]+	615.3	616.3	163.1	36
				293.1	22
				324.2	20
하이그로마이신 B (Hygromycin B)	[M+H]+	527.2	528.2	117.1	28
				257.0	28
				352.1	12
토브라마이신 (Tobramycin)	[M+H]+	467.3	468.2	163.0	24

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

8) 정성 및 확인시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (%)	허용범위
> 50%	≤ 20%
> 20% ≤ 50%	≤ 25%
> 10%, ≤ 20%	≤ 30%

겐타마이신 C1(GentamicinC1)	겐타마이신 C1a(GentamicinC1a)
겐타마이신 C2(GentamicinC2)	겐타마이신 C2a(GentamicinC2a)
네오마이신 (Neomycin)	디하이드로스트렙토마이신 (Dihydrostreptomycin)
스트렙토마이신 (Streptomycin)	스펙티노마이신 (Spectinomycin)
아미카신 (Amikacin)	아프라마이신 (Apramycin)
카나마이신 (Kanamycin)	파로모마이신 (Paromomycin)
하이그로마이신 B (Hygromycin B)	토브라마이신 (Tobramycin, 내부표준물질)

나) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프/질량분석기에서 표준품의 크로마토그램.

겐타마이신 C1(0.1 mg/L, 6.77분), 겐타마이신 C1a(0.1 mg/L, 6.59분), 겐타마이신C2(0.1 mg/L, 6.65분), 겐타마이신 C2a(0.1 mg/L, 6.79분), 네오마이신(0.5 mg/L, 6.93분),디하이드로스트렙토마이신(0.5 mg/L, 4.1분), 스트렙토마이신(0.5 mg/L, 4.02분), 스펙티노마이신(0.5 mg/L, 2.97분), 아미카신(0.1 mg/L, 4.95분), 아프라마이신(0.5 mg/L, 6.14분), 카나마이신(0.1 mg/L, 5.19분), 파로모마이신(0.01 mg/L, 6.93분), 하이그로마이신 B(0.01 mg/L, 3.78분), 토브라마이신(0.2 mg/L, 6.32분)

9) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후 공시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 표준물질의 정량이온(quantitative ion)과 내부표준물질의 정량이온의 각 피크 높이비 또는 피크 면적비에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

(단위: mg/kg)
물질명 (Compounds)	소고기	돼지고기	닭고기	알	유	넙치	장어	새우
겐타마이신 C1(Gentamicin C1)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
겐타마이신 C1a(Gentamicin C1a)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
겐타마이신 C2(Gentamicin C2)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
겐타마이신 C2a (Gentamicin C2a)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
네오마이신 (Neomycin)	0.01	0.05	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
디하이드로 스트렙토마이신 (Dihydrostreptomycin)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.008	0.005	0.005
스트렙토마이신 (Streptomycin)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.008	0.005	0.005
스펙티노마이신 (Spectinomycin)	0.01	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
아미카신 (Amikacin)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
아프라마이신 (Apramycin)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
카나마이신 (Kanamycin)	0.005	0.005	0.005	0.01	0.005	0.005	0.005	0.005
파로모마이신 (Paromomycin)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
하이그로마이신 (Hygromycin B)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005

나) 정량한계