8.3.5 노보비오신(Novobiocin), 티아물린(Tiamulin)

1) 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

검체를 아세토니트릴로 추출하여 아세토니트릴 포화헥산(알은 실리카 카트리지)으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래피용 및 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 100 mL 용량플라스크에 표준품을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 혼합표준용액: 100mL 용량플라스크에 각 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

마) 0.1% 개미산(formic acid) 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

바) 20 mM 개미산암모늄(ammonium formate) 함유 0.1% 개미산 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL와 1.26 g의 개미산암모늄을 넣고 녹인 후 물로 표시선까지 채운다.

사) 0.2% 개미산 함유 메탄올 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 2 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

아) 실리카 카트리지: 실리카(500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(3 mL) 또는 이와 동등한 것

자) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 알을 제외한 식품균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 아세토니트릴용액 10 mL를 가하여 15분간 진탕하고 상온에서 4,700G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 50 mL 원심분리관에 옮기고 아세토니트릴 포화헥산 10 mL을 가한 후 10분간 진탕하고 상온에서 4,700G로 10분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃에서 질소농축하여 건고한 후 0.1% 개미산 용액 2 mL과 메탄올 2 mL을 가하여 재분산하고 10분간 초음파 처리한 후 4℃에서 4,700G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 0.2 μm 막여과지(PVDF membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.

나) 알균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 아세토니트릴용액 10 mL를 가하여 15분간 진탕하고 상온에서 4,700G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 50 mL 원심분리관에 옮기고 아세토니트릴 포화헥산 10 mL을 가한 후 10분간 진탕하고 상온에서 4,700G로 10분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃에서 질소농축한 후 아세톤 : 디클로르메탄 혼압액(10 : 90, v/v) 10 mL에 녹인다. 미리 아세톤 : 디클로로메탄 혼합액(10 : 90, v/v) 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지에 추출액을 흡착시킨다. 아세톤 : 디클로로메탄 혼합액(10 : 90, v/v) 5 mL로 씻어준 후 고정상 상단이 노출되기 직전에 메탄올 : 아세톤 혼합액(10 : 90, v/v) 10 mL로 용출시켜 시험관에 받는다. 이를 40℃ 이하에서 질소농축하여 건고시킨 후 0.1% 개미산 용액 2 mL와 메탄올 2 mL를 가한다. 10분간 초음파 처리한 후 4℃에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 0.2 μm 막여과지(PVDF membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼: C18(Xselect, 2.1 mm ｘ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 0.2% 개미산 함유 메탄올 용액

(나) 이동상 B: 20 mM 개미산암모늄 함유 0.1% 개미산 용액

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	10	90
2.1	10	90
4	95	5
8	95	5
10	10	90
11	10	90

(3) 유속: 0.25 mL/분

(4) 칼럼온도: 40℃

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) 이온화 방법: ESI(Positive)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Capillary voltage: 3.5 kV

(4) Collision gas: Ar(아르곤)

(5) 분석대상 및 개별 조건(MRM 조건)

물질명 (Compound)	머무름 시간(분)	평균 분자량 (MW)	관측질량(Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision Energy, eV)
노보비오신 (Novobiocin)	5.76	612.6	612.2	613.3	132.9	62
					189.1	28
					218.1	12
티아물린 (Tiamulin)	5.20	493.7	493.3	493.9	72.9	48
					118.8	38
					191.9	14

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

7) 정성시험

가) 정성

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(response ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50 %	≤ 20 %
> 20 %, ≤ 50 %	≤ 25 %
> 10 %, ≤ 20 %	≤ 30 %

나) 표준품 크로마토그램

[IMG NAME : PIC1939444759]

노보비오신(5.76분)

[IMG NAME : PIC1939444761]

티아물린(5.20분)

그림 1. 노보비오신, 티아물린 표준품의 크로마토그램(각 0.01 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

정성시험과 똑같은 조건에서 음성검체(blank sample)에 혼합표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.

나) 정량한계

노보비오신 : 0.001 mg/kg

티아물린 : 0.001 mg/kg