8.3.6.2 제2법

1) 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

가) 축산물

시료중 니트로빈을 1% 암모니아 함유 아세토니트릴으로 추출하고 아세토니트릴 포화 헥산으로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

나) 수산물

시료중 니트로빈을 물:아세토니트릴(20:80, v/v) 혼합용액으로 추출하고 아세토니트릴 포화 헥산과 HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 메탄올에녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 1% 암모니아 함유 아세토니트릴로희석하여 사용한다.

마) 1% 암모니아 함유 아세토니트릴: 100 mL 용량플라스크에 수산화암모늄(28.2%) 3.55 mL를넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

바) 1% DMSO(dimethyl sulfoxide) 함유 메탄올: 100 mL 용량플라스크에 DMSO 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

사) 0.1%포름산(formic acid)수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL를 넣고 물로표시선까지 채운다.

아) 0.1%포름산함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

자) HLB 카트리지: HLB(200 mg) 고정상이 충전되어있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는이와 동등한 것

차) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 첨가시료의 조제

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다.

6) 시험용액의 조제

가) 축산물

균질화한시료2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취한다.1% 암모니아 함유 아세토니트릴 10 mL를넣고5분간흔들어 섞은 후4,700G, 4℃에서10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액을 모두 취하여 50 mL 원심분리관에 옮기고아세토니트릴 포화 헥산 10 mL를넣고5분간흔들어 섞은 후4,700G, 4℃에서 10분간원심분리한다. 원심분리한 하층액 중 5 mL를 취하여40℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물에물:아세토니트릴(30:70, v/v) 혼합용액 1 mL를넣어녹이고,0.2 μm PVDF (polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

나) 수산물

균질화한시료2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취한다.물:아세토니트릴(20:80, v/v)혼합용액 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4,700G, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액을 모두 취하여 50 mL 원심분리관에옮기고 아세토니트릴 포화 헥산 10 mL를넣고5분간흔들어 섞은 후4,700G, 4℃에서10분간 원심분리한다. 원심분리한 하층액 중 5 mL를 취하여 추출액으로 한다. 미리메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 HLB 카트리지에 추출액을 흡착시키고메탄올:물(20:80, v/v) 혼합용액 5 mL로유출시켜 버린 후, 1% DMSO 함유 메탄올 4 mL로용출하여 받는다. 용출액을 취하여40℃ 이하에서 질소농축하고 잔류물에물:아세토니트릴(30:70, v/v) 1 mL를넣어 녹이고,0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride)멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로한다.

7) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼:C18(2.1 mm ⨯ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1%포름산수용액

(나) 이동상 B: 0.1%포름산함유 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	90	10
6.0	10	90
8.0	10	90
8.1	90	10
12.0	90	10

(3) 유속: 0.3 mL/분

(4)컬럼온도: 40℃

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 500℃

(3) Capillary voltage: 3.8 kV

(4) Collision gas: 아르곤(Ar)

(5) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
니트로빈 (Nitrovin)	3.6	Positive	360.1	361	180	20
					222	15
					302	19

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

8) 정성 및 확인시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고,표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 니트로빈 표준용액(3.6분)의 크로마토그램(0.01 mg/L)

9) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

니트로빈: 0.005 mg/kg