8.3.12 노르제스토메트(Norgestomet), 디에네스트롤(Dienestrol), 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol), 알트레노제스트(Altrenogest), 에스트라디올(Estradiol-17β), 제라놀(Zeranol), 초산메드록시프로게스테론(Medroxyprogesterone acetate), 초산멜렌게스트롤(Melengestrol acetate), 초산트렌볼론(Trenbolone acetate), 테스토스테론(Testosterone), 프로게스테론(Progesterone), 헥스트롤(Hexestrol)
1) 시험법 적용범위
축·수산물 등에 적용한다. 단, 프로게스테론(Progesterone)의 경우 유 및 알은 제외한다.
2) 분석원리
검체 중 분석대상물질을 아세트산 함유 아세토니트릴/메탄올 혼합용액(1:1, v/v)으로 추출하고 헥산 또는 일차이차아민(Primary secondary amine, PSA)로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액: 각 동물용의약품 표준품을 100 mL 용량플라스크에 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.
라) 혼합표준용액: 100 mL 용량플라스크에 각 표준원액을 잔류허용기준의 10배 농도가 되도록 취하여 혼합한 후 메탄올로 표시선까지 채워 조제한다. 혼합표준용액은 메탄올로 희석하여 사용한다.
마) 10 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.6): 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산나트륨(Sodium acetate) 0.82 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다. 아세트산으로 pH 4.6이 되도록 조정하여 사용한다.
바) 1% 아세트산(Acetic acid) 함유 아세토니트릴/메탄올 혼합용액(1:1, v/v): 100 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL을 넣고 아세토니트릴/메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 표시선까지 채운다.
사) 0.1 mM 불화암모늄(Ammonium fluoride) 용액: 1,000 mL 용량플라스크 불화암모늄 3.7 mg을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
5) 시험용액의 조제
균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 10 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.6) 2 mL을 넣고 2분간 초음파 처리하여 균질화한다. β-글루쿠로니다제/아릴설파타제(β-Glucuronidase/Arylsulfatase) 20 μL를 첨가하고 65℃에서 1시간 중탕한 후 상온에서 냉각한다. 이 용액에 1% 아세트산 함유 아세토니트릴/메탄올(1:1, v/v) 혼합용액을 12 mL 가하여 10분간 초음파 처리 후 15분간 진탕하고 –4℃에서 9,300 G로 10분간 원심분리한다. (㉠돼지고기를 제외한 축수산물의 경우, 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 헥산 12 mL을 넣고 2분간 진탕한다. -4℃에서 9,300 G로 5분간 원심분리한 후 하층액을 취하여 감압농축한다. ㉡돼지고기의 경우, PSA 500 mg이 담겨진 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 5분간 진탕한다. -4℃에서 9,300 G로 5분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 감압농축한다.) 잔류물에 50% 메탄올 1 mL을 넣어 녹이고 상온에서 15,800 G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1) 칼럼: C18(Shim-pack, 2.1 mm × 100 mm, 2.0 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A: 0.1 mM 불화암모늄 용액
(나) 이동상 B: 메탄올

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	50	50
4.0	0	100
7.0	0	100
7.01	50	50
10.0	50	50

(3) 유속: 0.3 mL/분
(4) 칼럼온도: 40℃
(5) 주입량: 5 μL
나) 질량분석기 조건
(1) Ionization: ESI(Positive, Negative)
(2) Capillary temperature: 300℃
(3) Collision gas: N2 (질소)
(4) 분석대상물질의 개별 조건

연번	물질명 (Compound)	이온화 (Ionization mode)	머무름 시간(분)	분자량 (MW)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy,eV)
1	노르제스토메트 (Norgestomet)	Positive	3.91	372.5	373.0	313.3	-13.0
						271.2	-17.0
						109.2	-33.0
2	디에네스트롤 (Dienestrol)	Negative	3.69	266.3	264.9	92.8	26.0
						248.9	27.0
						220.9	26.0
3	디에틸스틸베스트롤 (Diethylstilbestrol)	Negative	3.67	268.4	266.9	236.9	29.0
						250.9	25.0
						221.9	35.0
4	알트레노제스트 (Altrenogest)	Positive	4.05	310.4	311.0	227.1	-24.0
						269.1	-15.0
						293.3	-18.0
5	에스트라디올 (Estradiol-17β)	Negative	3.67	272.4	271.0	144.9	41.0
						182.9	41.0
						143.1	54.0
6	제라놀 (Zeranol)	Negative	3.57	322.4	320.9	277.1	23.0
						303.0	22.0
						258.9	26.0
7	초산메드록시프로게스테론 (Medroxyprogesterone acetate)	Positive	4.19	386.5	387.0	327.4	-16.0
						123.1	-29.0
8	초산멜렌게스트롤 (Melengestrol acetate)	Positive	4.26	396.5	397.1	279.3	-21.0
						337.4	-16.0
						221.3	-41.0
9	β-트렌볼론 (β-Trenbolone)	Positive	3.38	270.4	271.0	199.2	-22.0
						253.3	-21.0
						165.1	-52.0
10	테스토스테론 (Testosterone)	Positive	3.73	288.4	289.0	97.1	-25.0
						109.2	-27.0
						79	-49.0
11	프로게스테론 (Progesterone)	Positive	4.28	314.5	315.0	96.9	-26.0
						109.2	-23.0
						297.3	-16.0
12	헥스트롤 (Hexestrol)	Negative	3.759	270.4	268.9	118.8	38.0
						133.9	16.0
						132.9	16.0

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함
7) 정성시험
가) 정성
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50 %	≤ 20 %
> 20 % ∼ ≤ 50 %	≤ 25 %
> 10 % ∼ ≤ 20 %	≤ 30 %

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 노르제스토메트, 디에네스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 알트레노제스트, 에스트라디올, 제라놀, β-트렌볼론, 테스토스테론, 프로게스테론, 헥스트롤 표준품의 크로마토그램(각 0.01 mg/L)
 
8) 정량시험
가) 정량
정성시험과 똑같은 조건에서 음성검체에(Blank sample)에 혼합표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.
나) 정량한계

동물용의약품	정량한계(mg/kg)
	식육	우유	알	수산물
노르제스토메트(Norgestomet)	0.002 (소: 0.00003)	0.00006	0.0008	0.003
디에네스트롤(Dienestrol)	0.003	0.004	0.003	0.003
디에틸스틸베스트롤 (Diethylstilbestrol)	0.0005	0.0004	0.0002	0.0004
알트레노제스트(Altrenogest)	0.0002	0.0002	0.00004	0.0002
에스트라디올(Estradiol-17β)	0.004	0.005	0.004	0.003
제라놀(Zeranol)	0.001 (소: 0.0005)	0.004	0.001	0.001
초산메드록시프로게스테론 (Medroxyprogesterone acetate)	0.002	0.003	0.0008	0.002
초산멜렌게스트롤 (melengestrol acetate)	0.001 (소: 0.0003)	0.002	0.0005	0.003
β-트렌볼론(β-Trenbolone)	0.004 (소: 0.0002)	0.004	0.003	0.002
테스토스테론(Testosterone)	0.002	0.002	0.001	0.002
프로게스테론(Progesterone)	0.004	-	-	0.002
헥스트롤(Hexestrol)	0.003	0.005	0.002	0.003