8.3.14반코마이신(Vancomycin)

1) 시험법 적용범위
축․수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리
시료중의 반코마이신을 20% 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase E xtraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 물에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물로 희석하여 사용한다.

마) 강 양이온교환 폴리머 카트리지: X-C(Styrene-divinylbenzene Polymer surfaced with a Strong Cation Exchanger Group) 또는MCX(Mixed mode Cation Exchange)카트리지(60 mg, 3 mL) 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제
균질화한시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 20% 아세토니트릴 15 mL를 넣은후 20분간 흔들어 섞어 추출 한 후, 7,600 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 50 mL 원심분리관에 옮긴다. 남은 액에 20% 아세토니트릴 10 mL를 넣고 위의 과정을 반복한 후 상층액을 합한다. 이 상층액에 헥산 10 mL를 넣고10분간흔들어 섞어 추출 한 후, 7,600 G에서 원심분리하고 하층액을 취한다. 위의 과정을 반복하여 얻은 하층액을 합하여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 3 mL와 물 3 mL 그리고 0.1%포름산수용액3 mL로 활성화시킨 X-C 카트리지에 추출용액을 흡착시킨다. 물 3 mL로유출시켜 버리고메탄올:수산화암모늄(97:3, v/v)혼합용액 3 mL로용출하여 받는다. 이 용출액을50℃ 이하에서 질소농축하고잔류물에 물 1 mL를 넣고녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 측정조건

(1) 액체크로마토그래프 조건

(가)컬럼:C18(2.1 mm× 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(나)컬럼온도: 40℃

(다) 이동상:0.1% 초산 함유 10% 아세토니트릴

(라) 유속: 0.2 mL/분

(마) 주입량: 10 μL

(2) 질량분석기 조건

(가)Ionization mode:ESI(positive)

(나) Capillary temperature: 320℃

(다) Collision gas: Ar(아르곤)

(라) Collision energy: 20eV

(바) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌 에너지 (Collisionenergy, eV)
반코마이신 (Vancomycin)	Positive	1147.4	725	1305, 144	20

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

반코마이신(Vancomycin): 0.001 mg/kg