8.3.16세프티오퍼(Ceftiofur)

8.3.16.1제1법

1) 시험법 적용범위

유, 산양유 등 유(乳)류 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료를 초산암모늄 수용액으로 희석하여 C18카트리지에 통과시키고 메탄올로용출하여 농축한 후 역상 크로마토그래프/자외선흡광검출기(UV photometricdetector)로 측정한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/자외선흡광검출기(UV photometric detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 0.1 M 초산완충용액 250 mL과 메탄올 250 mL에 녹여 표준원액으로 한다.

라) 표준용액: 세프티오퍼(Ceftiofur) 나트륨 표준품을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물에 녹인 후 희석하여 사용한다.

마) 0.1 M 초산암모늄 수용액:초산암모늄 3.8 g을물에 녹여 500 mL가 되게 한다.

바) 0.2 M 초산 수용액:빙초산 11.5 mL을물로 녹여 1 L가 되게 한다.

사) 0.2 M 초산나트륨 수용액:무수초산나트륨 16.4 g을1 L 플라스크에 넣어 물로 1 L가 되게 한다.

아)0.1 M 초산완충용액:0.2 M 초산 수용액 463 mL와 0.2 M 초산나트륨 수용액 37 mL를혼합한 뒤물로 1 L가 되게 한다.

자) SPE카트리지:Mega Bond Elut C18(Varian사, 1 g) 또는 이와 동등한 것

차) 기타시약: 특급또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

시료2 g을 50 mL 원심분리관에 담은 후0.1 M 초산암모늄 수용액 8 mL로희석한다. 가볍게흔들어 섞어 준 다음 미리메탄올 5 mL과 0.1 M 초산암모늄 수용액10 mL를유출시켜버린 후활성화시킨 C18컬럼(1 g, 6 mL)에 희석한 시료를 서서히 통과시킨다(1∼2 방울/초). 원심분리관을
0.1 M 초산암모늄 수용액 5 mL로 두 번 헹군 다음 SPE카트리지에유출시켜 버린다. 다시 컬럼을 0.1 M 초산암모늄 수용액 5 mL로 한번 더 유출시켜 버린 후진공을 걸어 C18컬럼을 건조시킨다.메탄올 3 ml를 넣어유리시험관에용출하여 받는다(5∼6 방울/초).추출액이 약 1 mL가 될 때까지 질소 농축한 후 농축액을 2 mL 메스플라스크로 옮긴다. 0.1 M 초산완충용액 0.4 mL으로유리시험관을 두 번 헹구어 플라스크에 취한 다음 완충용액으로 정확히2 mL가 되게 한다.0.2 μm멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 측정조건

(1)컬럼: C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2)이동상:0.1 M 초산완충용액:아세토니트릴(8:2, v/v) 혼합용액(0.2 μm 나일론-66 필터로 여과)

(3) 유속: 1.0 mL/분

(4) 측정파장: UV 293 nm

7) 정량시험

시험용액 및 표준용액 100 μL를 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각피크의 머무름 시간(retention time)을 비교해서 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 세프티오퍼(ceftiofur)의 함량을 구한다.

8.3.16.2제2법

1) 시험법 적용범위

유(乳)를 제외한 축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중 세프티오퍼(Ceftiofur)와 세프티오퍼의 체내 대사물질인데스후로릴세프티오퍼(Desfuroylceftiofur)를디티오에리스리톨(DTE, dithioerithritol)로 추출한 후 요오드아세트아미드(iodoacetamide)로 유도체화하여 최종 형성된 디티오에리스리톨 아세트아미드(dithioerithritol acetamide)의 총량을 측정하여 잔류된 세프티오퍼를 정량한다. 디티오에리스리톨 아세트아미드는 C18카트리지, 음이온교환카트리지, 양이온교환카트리지로 순서대로 정제한 후액체크로마토그래프/자외선흡광검출기(UV photometric detector)로 측정한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/자외선흡광검출기(UV photometric detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다)0.1% 트리플루오로초산 수용액: 트리플루오로초산 1 mL에 물을 넣어 1 L가 되게 한다.

라) 0.1% 트리플루오로초산 함유 아세토니트릴:트리플루오로초산 1 mL에 아세토니트릴을 넣어 1 L가 되게 한다.

마) 0.05 M 붕산완충용액(pH 9.0):붕산나트륨 19 g과 염화칼륨 3.7 g을 물에 녹여 1 L가 되게 한다.

바) 0.025 M 인산완충용액(pH 7.0): 인산이수소칼륨 3.4 g을 물에 녹여 1 L가 되도록 한 후 수산화칼륨용액을 이용하여 pH를 7.0으로 맞춘다.

사) 추출액(0.4% DTE용액): DTE 1 g을 0.05 M 붕산완충용액 250 mL에 녹인다.

아) 14% 요오드아세트아미드 용액: 요오드아세트아미드 7 g을 0.025 M 인산완충용액 50 mL에 녹인다.

자) C18카트리지: Mega Bond Elut C18SPE(Varian사) 또는 이와 동등한 것

차) 양이온 교환카트리지: Bond Elut LRC SCX SPE(Varian사) 또는 이와 동등한 것

카) 음이온 교환카트리지: Bond Elut LRC SAX SPE(Varian사) 또는 이와 동등한 것

타) 기타 시약: 특급또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가)첨가시료의 조제

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 10 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다.

나) 추출

시료처리 전 미리 균질화하여 냉동보관 하던시료를 시험 전일 4℃에서 서서히 해동하여 시험에이용한다.시료10 g에 추출액 140 mL를 넣은 후 15～30분간흔들어 섞어 추출한다. 이 중15 mL(시료 약 1 g에 해당함.)를 원심분리관에 담고50℃ 이하에서 20～30 rpm으로 15분간흔들어 섞는다.여기에 14% 요오드아세트아미드 용액 3 mL를 넣어 혼합한 후 실온에서 30분간 정치하여 유도체화 한다. 인산용액으로pH를 2.5±0.1로 맞춘 뒤잘 혼합한 다음 4℃의 원심분리기에서 20분간 원심분리한다.

다) 정제

①미리 C18카트리지에 메탄올 4 mL와 0.025 M 인산완충용액 5 mL를 차례로 유출시켜 버린 후활성화한 뒤 시험용액을 넣고 0.025 M 인산완충용액 5 mL와 0.01 N 수산화나트륨 수용액 3 mL 순으로 유출시켜 버린다. 이어서 15% 아세토니트릴 3 mL로 용출하여 받은 다음 전체 용량이 18 mL가 되도록 물을 넣고 잘 혼합한다.

②미리 음이온교환카트리지에 메탄올 2 mL를 흘리고 이어서 메탄올:0.1 M 염화나트륨 수용액(25:75, v/v) 혼합용액 2 mL와 물 1 mL로 두번 유출시켜 활성화한다. ①에서 18 mL로 희석한시료를 넣고 물 1 mL로 유출시켜 버린 후 아세토니트릴:5% 초산 수용액(5:95, v/v)혼합용액2.5 mL를 이용하여 용출하여 받고 전체의 용량이 12.5 mL 되도록 물로 희석한다.

③미리 양이온교환카트리지에 메탄올 1 mL를 흘리고 이어서 메탄올:0.1 M 염화칼슘(25:75, v/v)혼합용액 2 mL와 물 1 mL로 두번 유출시켜 버린 후 활성화한다. ②에서 12.5 mL로 희석한시료를 넣고 물 1 mL로 유출시켜 버린 후 아세토니트릴:0.1 M 염화나트륨 수용액(5:95, v/v)혼합용액 2.5 mL로 용출하여 받은 후 일정량으로 최종용액의 양을 맞춘 다음 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 측정조건

(1)컬럼: C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것.

(2)이동상

(가) 이동상 A: 0.1% 트리플루오로초산 수용액

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)	유속(mL/분)
5	85	15	1.0
10	75	25	1.0
25	50	50	1.5
45	100	0	1.0

(나) 이동상 B: 0.1% 트리플루오로초산 함유 아세토니트릴

(3) 유속: 1 mL/분

(4) 주입량: 50 μL

(5) 측정파장: UV 266 nm

7) 정량시험

첨가시료에서 취한 용액과 시험용액 50 μL를 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 첨가시료 용액을 주입한 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 면적과 농도와의 관계를 이용하여 검량선을 작성하고 시료에서의 농도를 계산한다.

8.3.16.3 제3법

1) 시험법 적용범위

수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료 중 세프티오퍼와 세프티오퍼의 체내 대사물질인 데스후로일세프티오퍼(Desfuroyl ceftiofur)를 디티오에리쓰리톨(DTE, dithioerythritol) 용액으로 추출한 후 요오드아세트아미드(iodoacetamide)로 유도체화하여 최종 형성된 데스후로일세프티오퍼아세트아미드(desfuroylceftiofur acetamide)를HLB(divinylbenzne-N-vinylpyrolidone copolymer)카트리지로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 0.025 M 인산완충용액(pH 7.0)으로 희석하여 사용한다.

마) 0.05 M 붕산완충용액(pH 9.0): 1,000 mL 용량플라스크에 붕산나트륨 19 g과 염화칼륨 3.7 g을 넣고 물로 녹여 표시선까지 채운다.

바) 0.025 M 인산완충용액(pH 7.0):1,000 mL 용량플라스크에 인산이수소칼륨 3.4 g을 넣고 물로 녹이고수산화칼륨용액을 이용하여 pH를 7.0으로 맞춘 후표시선까지 물로 채운다.

사)14% 요오드아세트아미드 용액: 요오드아세트아미드 7 g을 0.025 M 인산완충용액50 mL에녹인다.

아) 0.4% 디티오에리트리톨 용액: DTE 1 g을 0.05 M 붕산완충용액 250 mL에녹인다.

자) SPE 카트리지: HLB 카트리지(200 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

차)0.1% 포름산(formic acid) 수용액:1 L 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 표시선까지 물로 채운다.

카)0.1% 포름산 함유 아세토니트릴:1 L 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 표시선까지아세토니트릴로 채운다.

타) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화한시료1 g을 50 mL의 원심분리관에 취하고 0.4% DTE 용액 7 mL를넣고50℃이하에서 15분간 흔들어 섞는다.방냉한 후 14% 요오드아세트아미드 용액을넣어10 mL로정용하고 15분간흔들어 섞어 추출한후 실온에서 30분간 정치하여 유도체화 한다. 유도체화한후 인산 용액으로pH를 2.5±0.1로 맞추고,9,000G에서 10분간 원심분리한 뒤상층액을추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL를유출시켜 버린 후활성화시킨 HLB카트리지에 추출액 5 mL를 흡착시키고, 물 5 mL로유출시켜 버린후50% 아세토니트릴5 mL로용출하여 받는다.용출액은50℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은이동상 A 0.5 mL로 녹인 뒤 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)컬럼: C18(2.1 mm × 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

(2)컬럼온도: 40℃

(3) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1%포름산수용액

(나) 이동상 B: 0.1%포름산함유아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	100	0
5	85	15
8	80	20
9	10	90
12	10	90
13	100	0
15	100	0

(4) 유속: 0.3 mL/분

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Spray voltage: 5,000 V

(4) Collision gas: Ar(아르곤)

(5) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
데스후로일세프티오퍼아세트아미드 (Desfuroylceftiofur acetamide)	6.9	Positive	486.0	487	125	42
					166	34
					241	19

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7)정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

가) 유도체화된 표준품의 크로마토그램

그림 1. 데스후로일세프티오퍼아세트아미드(6.9분)표준품의 크로마토그램 (세프티오퍼로서 0.2 μg)

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 1 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

　　　　세프티오퍼(Ceftiofur):0.01 mg/kg