8.3.23세파세트릴(Cefacetrile), 세파피린(Cephapirin), 세팔로니움(Cefalonium), 세푸록심(Cefuroxime), 세프퀴놈(Cefquinome)

1) 시험법 적용범위
축·수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리
시료 중 세파세트릴, 세파피린, 세팔로니움, 세푸록심, 세프퀴놈 및 세파피린의 대사물질인 데스아세틸세파피린(Desacetylcephapirin)을 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 세파피린은 대사물질인 데스아세틸세파피린과의 합으로 정량한다.

3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

다)표준원액: 각표준품을 물에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동보관한다.

라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록물로 희석하여 사용한다. 조제된 표준용액은 냉장보관 한다.

라) 내부표준원액: 브루신(Brucine) 표준품을 정밀히 달아 물에 녹여 100 mg/L로 한다. 조제된 표준원액은 냉동보관 한다.

마) 내부표준용액: 내부표준원액을 물로 희석하여 1 mg/L가 되게 한다.

5) 시험용액의 조제
균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 내부표준용액 200 μL를 넣은 후 물 1 mL와 아세토니트릴 4 mL를 넣고 흔들어 섞는다 (단, 유(乳)의 경우 물 1 mL를 넣지 않는다). 이 용액을 3,000 G에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 헥산 10 mL를 미리 넣은 100 mL 분액 깔때기에 옮긴다. 다시 아세토니트릴 4 mL를 넣고 흔들어 섞어 추출 한 후 3,000 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 앞의 액과 합한다. 분액깔때기를 10분간 흔들어 섞은 다음 정치 하여층을 분리시킨 후 하층을 취하고 아세토니트릴을 넣어10 mL가 되게 한다. 이 용액 중 5 mL를 취하여 50℃ 이하에서 질소 농축 하고 잔류물은 0.05% 포름산 함유 아세토니트릴:물( 1:9, v/v ) 혼합용액 200 μL에 녹인다. 이 용액을 12,000 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 취한 후 멤브레인필터 로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

(가) 액체크로마토그래프 조건

(1)컬럼: C18(2.1 mm× 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

(2)컬럼온도: 35℃

(3) 이동상

(가) 이동상 A: 0.05%포름산 수용액

(나) 이동상 B:0.05%포름산 함유 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	90	10
10.0	50	50
10.1	10	90
20.0	10	90
20.1	90	10
35.0	90	10

(4) 유속: 0.2 mL/분

(5) 주입량: 20 μL

(나) 질량분석기 조건

(1) Ionization mode: ESI(positive, negative)

(2) Capillary temperature: 550℃

(3) Collision gas: Ar(아르곤)

연번	물질명 (Compound)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	세파세트릴 (Cefacetrile)	Positive	339.1	362	258 302 179	19
2	세파피린 (Cephapirin)	Positive	423.1	424	292 181 193	21
3	세팔로니움 (Cefalonium)	Positive	458.1	459	152 158 185	23
4	세푸록심 (Cefuroxime)	Negative	424.1	423	207 318 284	18
5	세프퀴놈 (Cefrquinome)	Positive	528.1	529	134 124 167	23
6	데스아세틸세파피린 (Desacetyl cephapirin)	Negative	381.1	380	302 149 336	14
7	브루신(내부표준물질) (Brucine, IS)	Positive	394.2	395	244 213 170	49

(4) 분석대상물질의 개별조건

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

8) 정량시험

(가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 표준물질의정량이온(quantitative ion)과 내부표준물질의 정량이온의 각 피크 높이비 또는 피크 면적비에따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

세파세트릴(Cefacetrile): 유(乳)(0.05 mg/kg), 유(乳)외 식품(0.03 mg/kg)

세파피린(Cephapirin): 0.03 mg/kg

세팔로니움(Cefalonium): 0.005 mg/kg

세푸록심(Cefuroxime): 0.01 mg/kg

세프퀴놈(Cefrquinome): 유(乳)(0.01 mg/kg), 유(乳)외 식품(0.03 mg/kg)

데스아세틸세파피린(Desacetyl cephapirin): 0.03 mg/kg