8.3.25 클로람페니콜(Chloramphenicol)

1) 시험법 적용범위
벌꿀, 로열젤리 등에 적용한다.

2) 분석원리
시료중 클로람페니콜을 물 또는 에틸아세테이트 등으로 추출한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지또는 헥산을 이용하여 정제하고 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제한 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올:물(1:1, v/v)로 희석하여 사용한다.

마) Divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone copolymer(충전제) 카트리지 컬럼: HLB(HydrophilicLipophilic Balance) 카트리지 또는 이와 동등한 것

바) 기타시약: 특급또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 벌꿀균질화한시료5 g에 물 20 mL를 넣고흔들어 섞어주며녹인다. 이 액을 미리 메탄올 5 mL와물 5 mL를유출시켜버린 후활성화시킨 HLB카트리지(충전제 60 mg)에 흡착시키고 20%메탄올 수용액 5 mL로유출시켜 버린후, 60% 메탄올 수용액 6 mL로용출하여 받는다.용출액을45℃ 이하에서감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 30% 아세토니트릴 수용액1 mL에 녹인 후0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

나) 로열젤리균질화한시료1 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 ⓐ 메탄올:1% 메타인산수용액(3:2, v/v) 혼합액 30 mL와 에틸아세테이트 15 mL를
넣고10분간흔들어 섞고 3,000 G에서 5분간 원심 분리한다. ⓐ과정을 2번 반복하여 상층액을 합치고 취합한 상층액이 15 mL가 될 때까지 45℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축 한다. 이 액을 미리 메탄올 10 mL와 물 10 mL를 유출시켜버린 후활성화시킨 HLB 카트리지(충전제 200 mg)에 흡착시키고 물 4 mL와 20% 메탄올 수용액 4 mL로 유출시켜 버린 후, 60% 메탄올 수용액 13 mL로 용출하여 받는다. 이때 용출액 중 처음 3 mL는 버리고 10 mL만 취한다. 취한 용출액은 45℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 30% 아세토니트릴 수용액 1 mL에 녹인 후 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 컬럼:C18(2 mm × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A:10 mM 초산암모늄 함유 0.1% 초산 수용액

(나) 이동상 B:아세토니트릴:이동상 A(95:5, v/v) 혼합용액

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	80	20
15.0	10	90
15.5	80	20
30.0	80	20

(다) 유속: 0.2 mL/분

(라) 컬럼 온도: 40℃

(마) 주입량: 20 μL

나) 질량분석기 조건

(가) Ionizationmode: ESI(negative)

(나) Scan width: 1.5 이하

(다) Capillarytemperature: 350℃

(라) Auxiliary gas:N2(질소)

(마) Collision gas:Ar(아르곤) 또는 He(헬륨)

물질명 (Compound)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)
클로람페니콜 (Chloramphenicol)	Negative	322.0	321	152 176 194 257

(바) 분석대상물질의 조건

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(production)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g(꿀) 또는 1 g(로열젤리)씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

클로람페니콜(Chloramphenicol): 0.0005 mg/kg (벌꿀)

클로람페니콜(Chloramphenicol): 0.005 mg/kg (로열젤리)