8.3.27티오우라실(Thiouracil)

1) 시험법 적용범위

축․수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중의 티오우라실을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가)용매: 액체크로마토그래프용또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와동등한 것

다) 표준원액: 각 표준품을메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록이동상으로 희석하여 사용한다.

마) 무수황산나트륨 함유 실리카 카트리지: Silica 카트리지(500 mg, 10 mL)에 무수황산나트륨1 g을 넣은 것 또는 이와 동등한 것

바) 기타시약: 특급또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화한시료5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를넣은 후5분간흔들어 섞어 추출한다. 3,000G에서 5분간 원심분리하고 상층액 중 5 mL를 취하여 시험관에옮긴 후 이를 60℃ 이하에서질소농축한다.잔류물을디클로로메탄 0.5 mL에 충분히 녹인 후 5분간 초음파 추출한다. 이 추출액을 디클로로메탄 2 mL로 미리 활성화시킨 무수황산나트륨 함유 실리카 카트리지에 흡착시키고 디클로르메탄 0.5 mL로 추출액을 담았던 시험관에넣고 초음파 추출하여 다시 카트리지에 흡착시킨다. 추출액이 흡착된 카트리지를 디클로로메탄2 mL로유출시켜 버리고,시험관에 다시메탄올:디클로로메탄(25:75, v/v)혼합용액 2 mL를넣고 1분간 초음파 추출한 용액으로용출하여 받는다.용출액을 60℃ 이하에서질소농축하고메탄올 200 μL와 0.1% 포름산 수용액 400 μL를넣고충분히 녹인 후멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 컬럼: C18(4.6 mm× 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가)이동상 A: 0.1%포름산 수용액

(나) 이동상 B:포름산:아세토니트릴:메탄올(1:500:500, v/v/v) 혼합용액

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	93	7
6.0	93	7
20.0	20	80
23.0	20	80
25.0	93	7
28.0	93	7

(3) 컬럼 온도: 40℃

(4) 유속: 0.5 mL/분

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization mode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 330℃

(3) Collision gas: Ar(아르곤)

(4) Collision energy: 21～25eV

(5) 분석대상물질의 개별조건

연번	물질명 (Compound)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)
1	2-티오우라실 (2-Thiouracil)	Positive	128.0	129	84 112
2	6-메틸-2-티오우라실 (6-Methyl-2-thiouracil)	Positive	142.0	143	126 84
3	6-프로필-2-티오우라실 (6-Propyl-2-thiouracil)	Positive	170.1	171	154 112
4	6-페닐-2-티오우라실 (6-Phenyl-2-thiouracil)	Positive	204.0	205	188 146

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료
(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

티오우라실(Thiouracil):0.025 mg/kg