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식품 및 식품첨가물공전
8.3.34톨페남산(Tolfenamic acid)
1) 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.
2) 분석원리
시료중의 톨페남산을 아세토니트릴로 추출하고, 헥산으로 지방 및 불순물을 제거한 후 pH를 맞춘 뒤 에틸아세테이트로 액-액 추출하여 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(UV photometric detector)로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/자외선흡광검출기(HPLC/UV photometric detector)
4) 시약 및 시액
가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.
라) 표준용액: 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록메탄올로 희석하여 사용한다.
마) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
5) 시험용액의 조제
시료5 g에 아세토니트릴을 10 mL씩 2회 넣고20분간흔들어 섞는다 . 4,800G에서 10분간 원심분리한 다음 상층액을 취해 헥산 20 mL를넣고 흔들어 섞은 뒤 방치하여 층을 분리시킨다.하층을 모아50℃ 이하에서 질소 농축후 잔류물을 에테르 4 mL로녹여,10분간흔들어 섞고,2 mM NaOH 수용액 10 mL(4 mL, 4 mL, 2 mL씩 세 번), NaCl 포화용액을 2 mM NaOH 수용액 1 mL당 75 μL씩넣어20분간흔들어 섞어 추출한 후4,700G에서 10분간 원심분리한다. 하층을 취해 새 튜브에 담은 후2% 아세트산 수용액 600 μL를 넣고약산성화 시킨다. 에틸아세테이트 40 mL(20 mL, 10 mL, 10 mL씩 세 번)를넣고20분간흔들어 섞어 추출한 후4,700G에서5분간 원심분리한다. 상층액을 취하여50℃ 이하에서 질소 농축후 다시 에틸아세테이트 5 mL (2 mL, 2 mL, 1 mL씩 세 번)로녹여50℃ 이하에서 질소 농축한다.잔류물에메탄올 500 μL를넣고10분간흔들어 섞어 준 뒤,4,700G에서 2분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1) 컬럼: C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 컬럼온도: 40℃
(3) 이동상:0.1% 초산 수용액:아세토니트릴(50:50, v/v) 혼합용액
(4) 유속: 1.0 mL/분
(5) 주입량: 10 μL
(6) UV 검출기 파장: 218 nm
나) 표준품 크로마토그램
그림 1. 톨페남산(12.6분) 크로마토그램
7) 정량시험
가) 정량
표준용액 및 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 피크 머무름 시간을비교하여 톨페남산의 피크 면적으로 검량선을 작성하고 시험용액 중 톨페남산 함량을 구한다.
나) 정량한계
톨페남산(Tolfenamic acid): 0.01 mg/kg(축산물,유(乳))
8) 확인시험
가) 액체크로마토그래프-질량분석기의 측정조건
(1) 컬럼: C18(2.0 mm × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A:0.2% 초산암모늄수용액
(나) 이동상 B:아세토니트릴
시간(분)
이동상 A(%)
이동상 B(%)
0
80
20
1
80
20
12
0
100
13
0
100
14
80
20
17
80
20
(3) 유속: 0.3 mL/분
(4) 컬럼 온도: 40℃
(5) Ionization mode: ESI(negative)
(6) Capillary temperature: 300℃
물질명
(Compound)
이온화
(Ionization mode)
관측질량
(Exact mass)
선구이온
(Precursor ion,m/z)
생성이온
(Product ion,m/z)
충돌에너지
(Collision energy, eV)
톨페남산
(Tolfenamic acid)
Negative
261.1
260
216
260
16
(7) 분석대상물질의 조건
나) 정성 및 확인
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
이온간 반응세기의 비율
(Base peak에 대한 %)
허용범위
> 50%
± 20%
> 20%, ≤ 50%
± 25%
> 10%, ≤ 20%
± 30%
축산물 등에 적용한다.
시료중의 톨페남산을 아세토니트릴로 추출하고, 헥산으로 지방 및 불순물을 제거한 후 pH를 맞춘 뒤 에틸아세테이트로 액-액 추출하여 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(UV photometric detector)로 분석한다.
액체크로마토그래프/자외선흡광검출기(HPLC/UV photometric detector)
시료5 g에 아세토니트릴을 10 mL씩 2회 넣고20분간흔들어 섞는다 . 4,800G에서 10분간 원심분리한 다음 상층액을 취해 헥산 20 mL를넣고 흔들어 섞은 뒤 방치하여 층을 분리시킨다.하층을 모아50℃ 이하에서 질소 농축후 잔류물을 에테르 4 mL로녹여,10분간흔들어 섞고,2 mM NaOH 수용액 10 mL(4 mL, 4 mL, 2 mL씩 세 번), NaCl 포화용액을 2 mM NaOH 수용액 1 mL당 75 μL씩넣어20분간흔들어 섞어 추출한 후4,700G에서 10분간 원심분리한다. 하층을 취해 새 튜브에 담은 후2% 아세트산 수용액 600 μL를 넣고약산성화 시킨다. 에틸아세테이트 40 mL(20 mL, 10 mL, 10 mL씩 세 번)를넣고20분간흔들어 섞어 추출한 후4,700G에서5분간 원심분리한다. 상층액을 취하여50℃ 이하에서 질소 농축후 다시 에틸아세테이트 5 mL (2 mL, 2 mL, 1 mL씩 세 번)로녹여50℃ 이하에서 질소 농축한다.잔류물에메탄올 500 μL를넣고10분간흔들어 섞어 준 뒤,4,700G에서 2분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
시간(분)
이동상 A(%)
이동상 B(%)
0
80
20
1
80
20
12
0
100
13
0
100
14
80
20
17
80
20
물질명
(Compound)
이온화
(Ionization mode)
관측질량
(Exact mass)
선구이온
(Precursor ion,m/z)
생성이온
(Product ion,m/z)
충돌에너지
(Collision energy, eV)
톨페남산
(Tolfenamic acid)
Negative
261.1
260
216
260
16
이온간 반응세기의 비율
(Base peak에 대한 %)
허용범위
> 50%
± 20%
> 20%, ≤ 50%
± 25%
> 10%, ≤ 20%
± 30%