8.3.36피페라진(Piperazine)

1) 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료 중의 피페라진을 2%포름산 수용액으로 추출하고, SPE(PCX) 카트리지로 정제한 후, 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/형광검출기(fluorescence detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 물에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 표준용액: 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록물로 희석하여 사용한다.

마) SPE 카트리지: Bond Elut Plexa PCX 카트리지(200 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

바) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가)유(乳)

균질화한시료5 mL에 2%포름산 함유아세토니트릴 3 mL를넣은 뒤,20분간흔들어 섞어 추출한다음 2%포름산수용액 12 mL를넣은 뒤,20분간흔들어 섞어 추출한다.이를4,000G에서 10분간 원심분리하고상층액을 새로운 tube에 모아40℃ 이하에서17 mL 이하로질소농축한다.미리 메탄올 3 mL와 2%포름산수용액 3 mL로 활성화시킨PCX cartridge에 추출액을 흡착시킨 다음 2%포름산수용액 3 mL와 메탄올 3 mL를차례로유출시켜 버린후,5% 메탄올성 수산화암모늄 용액 3 mL로 2회용출하여 받는다.용출액은40℃ 이하에서질소농축한다음, 0.1% 트리에틸아민(TEA) 1 mL로녹이고20분간흔들어 섞어 추출한 후, 아세토니트릴에녹인단실염화물 용액(0.5 mg/mL) 1 mL를넣고암실에서 40℃ 항온수조에 30분간 반응시킨 다음, 이를0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여시험용액으로 한다.

나)알(卵)

균질화한시료5 mL에 2%포름산함유 아세토니트릴 6 mL를넣은 뒤,20분간흔들어 섞어 추출한다음 2%포름산수용액 10 mL를넣고20분간흔들어 섞어 추출한다. 이를4,000G에서 10분간 원심분리하고상층액을 새로운 tube에 모아40℃ 이하에서 10 mL 이하로질소농축한다.미리 메탄올 3 mL와 2%포름산수용액 3 mL로 활성화시킨 PCX cartridge에 추출액을 흡착시킨 다음 2%포름산수용액 3 mL와 메탄올 3 mL를 차례로유출시켜 버린후,5% 수산화암모늄 함유 메탄올 3 mL로 2회용출하여 받는다.용출액은40℃ 이하에서질소 농축한다음, 0.1% 트리에틸아민 1 mL로녹이고20분간흔들어 섞어 추출한 후, 아세토니트릴에녹인단실염화물 용액(0.5 mg/mL) 1 mL를넣고암실에서40℃ 항온수조에 30분간 반응시킨 다음, 이를0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

다)유(乳), 알(卵)을 제외한 식품

균질화한시료5 g에 2%포름산수용액 15 mL를 넣은 뒤, 20분간흔들어 섞어 추출한 다음4,000G에서 10분간 원심분리하고상층액을 새로운 tube에 모은다. 남은 침전물에 다시 2%포름산수용액 10 mL를넣고20분간흔들어 섞어 추출한 다음4,000G에서 10분간 원심분리하고상층액을 이전의상층액과 합하여 추출액으로 한다. 미리 메탄올3 mL와 2%포름산수용액 3 mL로 활성화시킨 PCX cartridge에 추출액을 흡착시킨 다음2%포름산수용액 3 mL와 메탄올 3 mL를 차례로유출시켜 버린 후, 5% 수산화암모늄 함유 메탄올3 mL로 2회용출하여 받는다.용출액은40℃ 이하에서 질소농축한 다음, 0.1% 트리에틸아민 1 mL로녹이고20분간흔들어 섞어 추출한다. 아세토니트릴에녹인단실염화물 용액(0.5 mg/mL) 1 mL를넣고암실에서 40℃ 항온수조에 30분간 반응시킨 다음, 이를0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프/형광검출기 측정조건

(1) 컬럼: C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상:물:아세토니트릴(30:70, v/v) 혼합용액

(3) 유속: 1.0 mL/분

(4) 주입량: 20 μL

(5) 컬럼 온도: 30℃

(6) 측정파장: 여기파장-338 nm, 측정파장-523 nm

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 피페라진(17.4분) 표준품의 크로마토그램

7) 정량시험

가) 표준용액 및 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 피크 머무름 시간을비교하여 피페라진의 피크 면적으로 검량선을 작성하고 시험용액 중 피페라진 함량을구한다.

나) 정량한계

　　　피페라진(Piperazine)：0.02 mg/kg

8) 확인시험

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼: C18(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가)이동상 A:0.1% 아세트산 수용액

(나)이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	95	5
3.0	95	5
5.0	0	100
15.0	0	100
15.1	95	5
20.0	95	5

(3) 유속: 0.2 mL/분

(4)컬럼온도: 20℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(positive)

(2)Capillary temperature: 350℃

(3)Capilary voltage: 5,500 V

(4) Collision gas: N2(질소)

(5)분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collisionenergy, eV)
피페라진 (DNS-Cl-piperazine)	17.4	Positive	319.1	320.1	170.1 154.2	35 71

다) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%