8.3.39 펜타메틸렌테트라졸(Pentamethylenetetrazole)

1) 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리
시료 중의 분석대상물질을 포름산 함유 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 표준용액: 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

마) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제
균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관①에 취하고 0.1% 포름산 함유아세토니트릴 8 mL를 넣은 후5분간흔들어 섞는다 (유(乳)의 경우, 균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관①에 취하고 0.1% 포름산 함유아세토니트릴 8 mL와 황산나트륨 5 g을 넣은 후5분간 흔들어 섞는다 .).4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리하고 상층액을 50 mL 원심분리관②에 옮긴다. 원심분리 후남은잔류물에0.1% 포름산함유아세토니트릴 7 mL를넣고5분간흔들어 섞은 뒤4℃, 2,600G에서 15분간 원심 분리하여상층액을 원심분리관②에 합한다. 이 원심분리관②에 헥산 15 mL를넣고5분간흔들어 섞은후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리하여 하층액을 추출액으로 한다. 추출액을40℃ 이하에서 질소농축하고잔류물을메탄올 1 mL로 녹여 4℃, 15,000G에서 5분간원심분리한 후,0.2 μm 멤브레인필터로 여과시켜 시험용액으로한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼: C18(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A:10 mM 포름산암모늄 함유 0.1% 포름산 수용액

(나) 이동상 B:10 mM 포름산암모늄 함유 0.1% 포름산 메탄올

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
4	0	100
15	0	100
20	95	5
25	95	5

(3) 유속: 0.2 mL/분

(4)컬럼온도: 25℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Collision gas: N2(질소)

(4) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
펜타메틸렌테트라졸 (Pentamethylene tetrazole)	9.4	Positive	138.1	139	55	35
					69	39
					96	23

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고,표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 펜타메틸렌테트라졸(9.4분) 표준품의 크로마토그램

8) 정량시험

가) 정량조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

펜타메틸렌테트라졸(Pentamethylenetetrazole):0.001 mg/kg