8.3.47 나이트록소린(Nitroxoline)

1) 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중의 분석대상물질을 10 mM포름산암모늄 함유 아세토니트릴과 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨으로 추출하고 C18과 황산마그네슘으로 정제한후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 0.1% 삼불화초산 함유 메탄올에녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 표준용액: 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록0.1% 삼불화초산 함유 메탄올로 희석하여 사용한다.

마) 0.1% 삼불화초산(trifluroacetic acid, TFA)함유메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 삼불화초산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

바) 0.1% 삼불화초산함유아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 삼불화초산 1 mL를 넣고아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

사) 10 mM포름산암모늄(ammonium formate) 함유아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물 20 mL로잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화한 시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 10 mM포름산암모늄 함유아세토니트릴20 mL를넣고5분간흔들어 섞는다.여기에 염화나트륨 1 g, 황산마그네슘 4 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 넣어 15분간흔들어 섞은 후, 4℃, 2,600 G에서 15분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 취하고, C18150 mg과 황산마그네슘 900 mg을 넣어 10분간흔들어 섞은 후4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 15 mL 원심분리관에 취하여40℃ 이하에서0.5 mL가 될 때까지질소농축한다.농축액에0.1% 삼불화초산 함유 아세토니트릴 1.5 mL를넣은 뒤 녹이고4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하여0.45 μm PTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)컬럼: C18(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1% 삼불화초산수용액

(나) 이동상 B: 0.1% 삼불화초산함유아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
6	5	95
13	5	95
15	95	5
20	95	5

(3) 유속: 0.25 mL/분

(4)컬럼온도: 30℃

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Collision gas: N2(질소)

(4) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
나이트록소린 (Nitroxoline)	9.10	Positive	190.0	191.2	145.1	27
					127.0	43
					117.1	41

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 나이트록소린(9.10분,0.01 mg/L) 표준품의 크로마토그램

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

나이트록소린(Nitroxoline)：0.005 mg/kg