8.3.51 하이드록시디메틸피리미딘(2-Hydroxy-4,6-dimethylpyrimidine)

1) 시험법 적용범위

축‧수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중의 분석대상물질을10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 아세토니트릴로추출하고 헥산으로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

마) 10 mM 포름산암모늄 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산암모늄0.63 g을 넣고 물로표시선까지 채운다.

바) 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 물 20 mL와포름산암모늄0.63 g을 넣고 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

사) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화한 시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴20 mL를 넣고 15분간흔들어 섞은 후, 4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 상층액을50 mL 원심분리관에 취하고 여기에 헥산 20 mL를넣고10분간흔들어 섞은 후4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 담아40℃ 이하에서 0.5 mL가될 때까지질소농축한 후농축액에아세토니트릴 1.5 mL를넣어 녹이고4℃, 15,000G에서10분간원심분리하여 얻은 상층액을0.45 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)컬럼:HILIC(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm)또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A:10 mM 포름산암모늄 수용액

(나) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	25	75
10	25	75

(3) 유속: 0.2 mL/분

(4)컬럼온도: 30℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Collision gas: N2(질소)

(4)분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
하이드록시디메틸피리미딘 (2-Hydroxy-4,6-dimethylpyrimidine)	1.89	Positive	124.1	125.1	82.2	23
					42.2	43
					107.1	21

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료
(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 하이드록시디메틸피리미딘(1.89분) 표준품의 크로마토그램(0.01 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

하이드록시디메틸피리미딘(2-Hydroxy-4,6-dimethylpyrimidine):0.002 mg/kg