8.3.52 니트로푸라존(Nitrofurazone)

1) 시험법 적용범위

수산물 중 갑각류에 적용한다.

2) 분석원리

시료중 니트로푸라존(Nitrofurazone)을0.2% 메타인산 수용액:메탄올(6:4, v/v)혼합용액으로 추출하고HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance)카트리지로정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.니트로푸라존은 빛에쉽게 분해되므로 실험과정에사용되는 초자는갈색유리병을 사용하거나호일로 감싸 빛을 차단하여 실험한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액:표준품을 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 표준용액: 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록10 mM 암모늄아세테이트 수용액으로 희석하여 사용한다.

마) 10 mM 암모늄아세테이트(ammonium acetate) 수용액:1,000 mL 용량플라스크에암모늄아세테이트 0.78 g을 넣고 물에 녹여 표시선까지채운다.

바) 0.2% 메타인산 수용액:메탄올(6:4, v/v) 혼합용액:1,000 mL 용량플라스크에메타인산2g을 넣고물에 녹여표시선까지 채운 후메탄올과 6:4의 비율로 혼합하여 추출용액으로 사용한다.

사) HLB 카트리지(6 mL, 200 mg)또는 이와 동등한 것

아) 기타시약: 특급또는 이와 동등한 것

자) 용기: 갈색 유리기구

5) 시험용액의 조제

균질화한시료5 g을 정밀히 달아 용기에 넣고0.2%메타인산:메탄올(6:4, v/v)혼합용액100 mL를넣고1분간흔들어 섞어추출한다.이 용액을whatmanNo.6여과지가 깔린 뷰흐너깔때기로 감압 여과한다.이 여과액{단, (껍질을 포함하는)민물새우의 경우 여과액을 4℃에서12,000G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 사용}은40°C이하에서20〜30 mL가 되게감압(또는 질소)농축한다. 미리 메탄올 5 mL, 물5 mL로활성화시킨HLB 카트리지에추출액을흡착시키고 10% 메탄올 5 mL로유출시켜 버린 뒤, 메탄올 5 mL로용출하여 받는다.용출액은 40℃이하에서질소농축한 후, 잔류물은 10 mM 암모늄아세테이트:아세토니트릴(3:7, v/v) 혼합용액 1 mL로녹이고0.2 μm멤브레인필터로여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)컬럼: C18(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A:10 mM 암모늄아세테이트 수용액

(나) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	95	5
0.5	95	5
1.5	70	30
2.0	70	30
3.0	95	5
5.0	95	5

(3) 유속: 0.3 mL/분

(4)컬럼온도: 35℃

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(negative)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Capillary voltage: 2.8 kV

(4) Collision gas: Ar(아르곤)

(5) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compounds)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
니트로푸라존 (Nitrofurazone)	1.87	Negative	198.0	197.1	124.1	10
					149.9	10
					79.9	10

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 니트로푸라존(1.9분)표준품의 크로마토그램(0.005 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

니트로푸라존(Nitrofurazone): 0.005 mg/kg (껍질을 포함하는 민물새우)

니트로푸라존(Nitrofurazone): 0.001 mg/kg (민물새우를 제외한 갑각류(가식부))