10.1.3.1 CTAB법에 의한 DNA 추출방법

가. 시약의 조제

1) CTAB 완충용액

비커에 0.5 M EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) 용액(pH 8.0) 8 mL, 1 M Tris-염산 완충용액(pH 8.0) 20 mL, 5 M 생리식염수 56 mL를 넣고 증류수로 약 150 mL가 되도록 한 후, CTAB 4 g을 가하여 완전히 용해시킨다. 증류수를 넣어 전체 양을 200 mL로 조정한 후, 121℃에서 15분간 가압멸균한다.

2) 페놀-클로로포름 혼합액

1 M Tris-염산 완충용액(pH 8.0)으로 포화한 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알코올을 25:24:1(v/v/v)로 혼합한다.

3) 클로로포름-이소아밀알코올 혼합액

클로로포름과 이소아밀알코올을 24:1(v/v)로 혼합한다.

4) TE 완충용액(pH 8.0)

각각의 최종농도가 10 mM Tris-염산 완충용액(pH 8.0), 1 mM EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) 용액(pH 8.0)이 되도록 멸균증류수를 사용하여 조제한다.

나. DNA 추출

균질하게 분쇄된 검체 2 g을 폴리프로필렌 튜브(50 mL용)에 넣고, CTAB 완충용액 15 mL를 가하여 교반기(vortex mixer)로 잘 섞은 후 추가로 CTAB 완충용액 30 mL를 가하고 55℃에서 30분간 반응시킨다. 이때 매 10분마다 10초간 교반기를 사용하여 검체와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. 30분간 반응 이후 교반기로 충분히 혼합하여 균질화한 용액 600μL를 1.5 mL 튜브에 넣고 페놀-클로로포름 혼합액 500μL를 가하여 잘 혼합한 후 12,000G로 15분간 실온에서 원심분리한다. 중간층에 닿지 않도록 조심해서 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮긴 후 클로로포름-이소아밀알코올 혼합액 500μL를 가하여 교반기를 이용하여 잘 혼합한 후, 12,000G로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 다시 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮기고 동량의 이소프로판올을 가하여 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후, 12,000G로 10분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액을 버리고, 침전물에 500μL의 70% 에탄올을 벽면으로 천천히 가한 후 12,000G로 1분간 실온에서 원심분리하고, 침전물에 닿지 않도록 주의하면서 상층액을 마이크로피펫으로 제거한 후 침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. TE 완충용액(pH 8.0) 50μL를 가하여 잘 혼합하고, 실온에서 15분간 때때로 흔들어주면서 완전히 녹인다(잘 녹지 않으면 4℃에서 12～24시간 정치하면서 완전히 녹인다). 추출된 DNA를 정제하기 위하여 위의 용액에 RNase A (10 ㎎/mL) 5μL를 가하여 37℃에서 30분간 정치한다. 200μL의 CTAB 완충용액을 가한 후, 클로로포름-이소아밀알코올 혼합액 250μL를 가하여 교반기로 가볍게 혼합하여, 실온에서 12,000G로 15분간 실온에서 원심 분리한 후, 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮긴다. 이때 중간층에 닿지 않도록 조심해서 상층액을 취한다. 200μL의 이소프로판올을 가하여 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후, 12,000G로 10분간 실온에서 원심분리한다. 침전물에 닿지 않도록 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 버리고, 200μL의 70% 에탄올을 벽면으로 조심스럽게 가하여 침전물을 씻어낸 후, 다시 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거한다. 그런 다음 12,000G로 1분간 실온에서 원심분리하여 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거하고 침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. 건조된 침전물에 50μL의 멸균수 또는 TE 완충용액(pH 8.0)을 가하고 실온에서 15분간 때때로 흔들어주면서 완전히 녹여 이를 DNA 원액으로 한다(잘 녹지 않으면 4℃에서 12～24시간 정치하면서 완전히 녹인다).