10.1.3.3 알팔파(alfalfa)의 DNA 추출

분쇄한 시료 0.5 g을 폴리프로필렌 튜브(50 mL용)에 넣고, 55℃로 CTAB 완충용액(미리 55℃로 가온한 것) 6 mL, 2-Mercaptoethanol 0.12 mL, proteinase K용액(20 ㎎/mL) 30μL를 가하여 교반기로 잘 섞은 후 추가로 10%(w/v) SDS 800μL를 가하여 잘 혼합한 다음 65℃ 항온수조에서 20분간 반응시킨다. 이때 매 10분마다 10초간 교반기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. 반응 후 교반기로 충분히 혼합하고 페놀-클로로포름 혼합액 4 mL를 가하여 혼합한 후 37℃에서 40분간 225 rpm으로 진탕반응시킨다. 충분히 혼합한 후 5,000G로 15분간 4℃에서 원심분리한다. 상층액을 새로운 50 mL 튜브에 옮기고 클로로포름-이소아밀알코올 혼합액 4 mL를 가하여 진탕배양기로 37℃에서 40분간 225rpm 섞어주면서 진탕반응시킨 후 5,000G로 15분간 4℃에서 원심분리한다. 다시 상층액을 새로운 50 mL 튜브에 옮기고 5 M 포타슘아세테이트(KOAc) 2 mL를 가하여 DNA를 침전시킨 후 상하로 10회 정도 뒤집어 주고 얼음 속에서 30분간 정치한다. 혼합액에 이소프로판올 4 mL를 가한 후 상하로 10회 뒤집어 주고 5,000G로 1분간 원심분리한다. 상층액을 제거한 후 70%(v/v) 에탄올 2 mL를 가하여 튜브 벽에 붙은 침전물이 분리될 때까지 조심스럽게 씻어 내고 5,000G로 1분간 원심분리한다. 상층액을 마이크로피펫으로 제거하고 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. 건조된 침전물에 멸균증류수 또는 TE 완충용액(pH 8.0) 500μL를 가하고 50℃에서 2시간 동안 때때로 섞어주면서 녹여 이를 DNA 시료 원액으로 한다.