10.1.5 정성시험

가. 분석원리

정성분석은 일반 PCR 장치를 이용하며, 추출된 DNA를 주형 DNA (template DNA)로 하여 검색하고자 하는 DNA의 프라이머를 이용하여 DNA를 증폭한 후 전기영동에 의하여 증폭된 DNA를 확인한다.

나. 실험시 주의사항

PCR에서는 주형 DNA가 소량 존재하여도 증폭되므로 추출된 DNA 이외의 DNA(특히 PCR 증폭산물)가 혼입되지 않도록 실험에 사용되는 기구 및 시약은 물론 실험실 환경의 관리에 주의해야 한다. 또한, DNA는 인간의 피부 표면에서 분비되고 있는 DNA 분해효소에 의해 분해될 수 있기 때문에 이러한 효소의 혼입을 방지하기 위하여 사용하는 모든 튜브와 팁은 사용하기 전에 121℃에서 20분 이상 가압멸균 처리한 1회용품을 사용한다. 각종 시액 조제에 사용하는 용액류 등도 열에 불안정한 것은 제외하고 모두 121℃에서 15분 이상 가압멸균 처리하여 사용한다. 멸균증류수나 TE 완충용액(pH 8.0)에 DNA 분해효소가 혼입되면 피해가 확산되므로 각 실험자마다 별도로 제조하여 사용하며, 조금씩 자주 만들어 사용한다. DNA를 취급할 때에는 무균대(clean bench)와 같은 독립된 공간을 사용하며, 실험대 위를 70% 에탄올로 깨끗이 닦고, 반드시 실험용 고무장갑 등을 착용하며, 실험용 고무장갑은 표면에 분말이 없는 것을 사용한다.

다. 시약 및 시액

1) 프라이머의 준비

유전자변형식품 표시제와 관련하여 PCR에 의한 유전자변형 콩, 유전자변형 옥수수의 검출에 사용되는 프라이머는 표 1, 표 2와 같다.그밖에 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머 또는 GMO 검출키트를 이용할 수 있으나, PCR 증폭산물이 200 bp 이상이 되게 하는 프라이머는 가공식품 분석용으로 적합하지 않다.

2) PCR용 시약의 조제

TaqDNA polymerase(이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 DNA polymerase도 사용할 수 있다) 등의 필요한 시약을 갖추어 PCR을 실시한다. 필요한 시약 및 절차는 다음과 같으며, 추출한 DNA를 주형으로 유전자가 증폭되는 것을 확인하기 위하여 반드시 각 원료에 대응하는 내재성 유전자용 프라이머를 이용한 PCR을 함께 행하여 목적하는 증폭산물이 얻어지는 지를 확인해야 한다.

가) 반응대조군으로 사용되는 표준 DNA 용액의 조제검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 표준품과 0%인 표준품(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 각각 DNA를 추출한 DNA 용액을 양성 대조군으로 사용한다. 다만, 표 3의 프라이머나 GMO 검출키트 등을 사용하여 PCR하는 경우 양성 확인용 표준품에서 추출한 DNA 외에도 해당 프라이머 제조사에서 특이적으로 제작한 양성 확인용 플라스미드 DNA 등을 반응대조군으로 사용할 수 있다.

나) PCR 반응 시약의 조제PCR 반응에 필요한 시약은 ㉮TaqDNA polymerase(내열성 DNA 중합효소), ㉯ dNTPs(deoxynucleotides 용액), ㉰ PCR 완충용액(MgCl2가 포함되지 않은 경우 별도의 MgCl2가 필요함), ㉱ 프라이머이며, 표 1, 표 2의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 반응액의 일반적 조성은 표 4와 같다.

다) 반응 대조군의 조제각 PCR 반응시에는 음성대조군(negative control)으로 ㉮ DNA를 함유하지 않는 것(PCR 반응계의 오염 확인용), ㉯ 프라이머를 함유하지 않는 것(프라이머를 제외한 반응계의 오염 확인용)을, 양성대조군(positive control)으로 ㉰ 비유전자변형(non-GMO) DNA를 함유한 것(DNA 추출이 올바르게 이루어졌는가의 확인용이며, 동일 작물로서 0%표준품에서 추출한 DNA 등), ㉱ 검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 것(PCR 반응계가 올바르게 이루어졌는가의 확인용이며, 동일 작물로서 분석 대상 GMO를 포함하는표준품에서 추출한 DNA 등)을 검체와 함께 PCR 시험을 한다.

표 1. 유전자변형 콩의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	이벤트 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	콩 lectin (118 bp)	Le1n02-5'	5'-GCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3'
		Le1n02-3'	5'-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TT-3'
		Le1-Taq	5'-FAM-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC-TAMRA-3'
	콩 lectin (74 bp)	GM1-F	5'-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3'
		GM1-R	5'-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3'
		GM1-P	5'-FAM-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC-TAMRA-3'
스크 리닝 Ⅰ법	CaMV P35S (101 bp)	P35S 1-5'	5'-ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T-3'
		P35S 1-3'	5'-CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T-3'
		P35S-Taq	5'-FAM-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-TAMRA-3'
	tNOS (151 bp)	NOS ter 2-5'	5'-GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3'
		NOS ter 2-3'	5'-CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T-3'
		NOS-Taq	5'-FAM-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-TAMRA-3'
스크 리닝 Ⅱ법	P-RbcS4 (113 bp)	P-RbcS4-F1_113	5'-AAG CAC CAC TCC ACC ATC AC-3'
		P-RbcS4-R1_113	5'-AGG TGT TGA GAC CCT TAT CG-3'
		P-RbcS4-P	5'-FAM-ACG TGG CAT TAT TCC AGC GG-TAMRA-3'
	tNOS (151 bp)	NOS ter 2-5'	5'-GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3'
		NOS ter 2-3'	5'-CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T-3'
		NOS-Taq	5'-FAM-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-TAMRA-3'
	T-E9 (103 bp)	T-E9_NF_103	5'-TTC GTT CGT ATC ATC GGT TTC-3'
		T-E9_NR_103	5'-CCC AAT GCC ATA ATA CTC GAA-3'
		T-E9_NP	5'-FAM-AAT GCA TCA GTT TCA TTG CG-TAMRA-3'
	pat (108 bp)	pat 108F	5'-CGC GGT TTG TGA TAT CGT TAA C-3'
		pat 108R	5'-TCT TGC AAC CTC TCT AGA TCA TCA A-3'
	pat (136 bp)	pat 136-F	5'-CGA TCC ATC TGT TAG GTT GC-3'
		pat 136-R	5'-CCT TGG AGG AGC TGG CAA CT-3'
		pat 136-P	5'-FAM-ATA CAA GCA TGG TGG ATG GC-TAMRA-3'
	CV127 (135 bp)	CV127-F	5'-GCC CTC CTT ATT TAT CCC CTT AG-3'
		CV127-R	5'-GGT TCG TTT AAG GAT GAA AAT TG-3'
	CV127 (88 bp)	SE-127-f4	5'-AAC AGA AGT TTC CGT TGA GCT TTA AGA C-3'
		SE-127-r2	5'-CAT TCG TAG CTC GGA TCG TGT AC-3'
		SE-127-p3	5'-6FAM-TTT GGG GAA GCT GTC CCA TGC CC-TAMRA-3'
	DP305423-1 (149 bp)	DP305 f7-5'	5'-CCC GTG TTC TCT TTT TGG CTA-3'
		DP305 r7-3'	5'-TGA ATT TCT AAC CTG GCT GCT ATA GTT-3'
	DP305423-1 (93 bp)	DP305423-f1	5'-CGT GTT CTC TTT TTG GCT AGC-3'
		DP305423-r5	5'-GTG ACC AAT GAA TAC ATA ACA CAA ACT A-3'
		DP305423-1p	5'-FAM- TGA CAC AAA TGA TTT TCA TAC AAA AGT CGA GA-TAMRA-3'
	DP356043-5 (145 bp)	DP356-f8-5'	5'-CTT TTG CCC GAG GTC GTT AG-3'
		DP356-r8-3'	5'-GCC CTT TGG TCT TCT GAG ACT G-3'
	DP356043-5 (99 bp)	DP356-f1	5'-GTC GAA TAG GCT AGG TTT ACG AAA AA-3'
		DP356-r1	5'-TTT GAT ATT CTT GGA GTA GAC GAG AGT GT-3'
		DP356-p	5'-FAM-CTC TAG AGA TCC GTC AAC ATG GTG GAG CAC-TAMRA-3'
구조 유전자	RRS (GTS40-3-2) (121 bp)	RRS 01-5'	5'-CCT TTA GGA TTT CAG CAT CAG TGG-3'
		RRS 01-3'	5'-GAC TTG TCG CCG GGA ATG-3'
		RRS-Taq	5'-FAM-CGC AAC CGC CCG CAA ATC C-TAMRA -3'
	MON89788 (139 bp)	MON89788-5'	5'-TCC CGC TCT AGC GCT TCA AT-3'
		MON89788-3'	5'-TCG AGC AGG ACC TGC AGA A-3'
		MON89788-Taq	5'-FAM-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-TAMRA-3'
	A2704-12 (153 bp)	YjA2704-F	5'-GGG CGT TCG TAG TGA CTG AG-3'
		YjA2704-R	5'-GCG TTA CCC AAC TTA ATC GC-3'
	A2704-12 (64 bp)	KVM175-5'	5'-GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT-3'
		SMO001-3'	5'-ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT-3'
		A2704-12-Taq	5'-FAM-CGG TCC TCC GAT CGC CCT TCC-TAMRA-3'
	DP356043-5 (145 bp)	DP356-f8-5'	5'-CTT TTG CCC GAG GTC GTT AG-3'
		DP356-r8-3'	5'-GCC CTT TGG TCT TCT GAG ACT G-3'
	DP356043-5 (99 bp)	DP356-f1	5'-GTC GAA TAG GCT AGG TTT ACG AAA AA-3'
		DP356-r1	5'-TTT GAT ATT CTT GGA GTA GAC GAG AGT GT-3'
		DP356-p	5'-FAM-CTC TAG AGA TCC GTC AAC ATG GTG GAG CAC-TAMRA-3'
	DP305423-1 (149 bp)	DP305 f7-5'	5'-CCC GTG TTC TCT TTT TGG CTA-3'
		DP305 r7-3'	5'-TGA ATT TCT AAC CTG GCT GCT ATA GTT-3'
	DP305423-1 (93 bp)	DP305423-f1	5'-CGT GTT CTC TTT TTG GCT AGC-3'
		DP305423-r5	5'-GTG ACC AAT GAA TAC ATA ACA CAA ACT A-3'
		DP305423-1p	5'-FAM- TGA CAC AAA TGA TTT TCA TAC AAA AGT CGA GA-TAMRA-3'
	A5547-127 (150 bp)	A5547-127-5'	5'-TGT GGT TAT GGC GGT GCC ATC-3'
		A5547-127-3'	5'-TGC TAC AGG CAT CGT GGT GTC-3'
	A5547-127 (75 bp)	A5547-127Q-5'	5'-GCT ATT TGG TGG CAT TTT TCC A-3'
		A5547-127Q-3	5'-CAC TGC GGC CAA CTT ACT TCT-3'
		A5547-127-Taq	5'-FAM-CCG CAA TGT CAT ACC GTC ATC GTT GT-TAMRA-3'
	MON87701 (150 bp)	MON87701-5'	5'-GCA CGC TTA GTG TGT GTG TCA AAC-3'
		MON87701-3'	5'-GGA TCC GTC GAC CTG CAG TTA AC-3'
	MON87701 (89 bp)	MON87701Q-5'	5'-CGT TTC CCG CCT TCA GTT TAA A-3'
		MON87701Q-3'	5'-TGG TGA TAT GAA GAT ACA TGC TTA GCA T-3'
		MON87701-Taq	5'-FAM-TCA GTG TTT GAC ACA CAC ACT AAG CGT GCC-TAMRA-3'
	CV127 (135 bp)	CV127-F	5'-GCC CTC CTT ATT TAT CCC CTT AG-3'
		CV127-R	5'-GGT TCG TTT AAG GAT GAA AAT TG-3'
	CV127 (88 bp)	SE-127-f4	5'-AAC AGA AGT TTC CGT TGA GCT TTA AGA C-3'
		SE-127-r2	5'-CAT TCG TAG CTC GGA TCG TGT AC-3'
		SE-127-p3	5'-6FAM-TTT GGG GAA GCT GTC CCA TGC CC-TAMRA-3'
	MON87705 (92 bp)	MON87705-1	5'-CTC CAT ATT GAC CAT CAT ACT CAT TG-3'
		MON87705-2	5'-GAT AAC AAC ACC CTG AGT CTC TTC-3'
	MON87705 (86 bp)	MON87705 primer1	5'-TTC CCG GAC ATG AAG CCA TTT AC-3'
		MON87705 primer2	5'-ACA ACG GTG CCT TGG CCC AAA G-3'
		MON87705 probe	5'-FAM-AAG AGA CTC AGG GTG TTG TTA TCA CTG CGG-TAMRA-3'
	MON87708 (105 bp)	87708-1GB	5'-CCA CGA GCT TAT CCA CGA GCA TC-3'
		87708-2GB	5'-CGC CTT CAG TTT AAA CTA TCA GTG T-3'
	MON87708 (96 bp)	MON87708Q primer1	5'-TCA TAC TCA TTG CTG ATC CAT GTA G-3'
		MON87708Q primer2	5'-AGA ACA AAT TAA CGA AAA GAC AGA ACG-3'
		MON87708Q probe	5'-FAM-TCC CGG ACT TTA GCT CAA AAT GCA TGT A-TAMRA-3'
	MON87769 (111 bp)	MON87769G-1	5'-ATG TAG ATT TCC CGG ACA TGA AGC-3'
		MON87769G-2	5'-GTA TGC TCG ACA CTT GTC TTT TCT TTC-3'
	MON87769 (87 bp)	MON87769 primer1	5'-CAT ACT CAT TGC TGA TCC ATG TAG ATT-3'
		MON87769 primer2	5'-GCA AGT TGC TCG TGA AGT TTT G-3'
		MON87769 probe	5'-FAM-CCC GGA CAT GAA GCC ATT TAC AAT TGA C-TAMRA-3'
	FG72 (115 bp)	SHA130	5'-CTA TAT TCT GGT TCC AAT TTA TC-3'
		SMP178	5'-TGA GGC ACG TAT TGA TGA CC-3'
	FG72 (70 bp)	MAE071	5'-AGA TTT GAT CGG GCT GCA GG-3'
		SHA097	5'-GCA CGT ATT GAT GAC CGC ATT A-3'
		TM325	5'-FAM-AAT GTG GTT CAT CCG TCT T-MGBNFQ-3'
	DAS-44406-6 (145 bp)	4406-1F	5'-GCG CAC CCT ACG ATT CAG TGT-3'
		4406-1R	5'-AAT TGC GAG CTT TCT AAT TTC AAA C-3'
	DAS-44406-6 (99 bp)	DAS-44406-5F	5'-TTA TTG TTC TTG TTG TTT CCT CTT TAG G-3'
		DAS-44406-5R	5'-CCT CAA TTG CGA GCT TTC TAA TTT-3'
		DAS-44406-6-5p1	5'-FAM-ATT CGG ACC TCC ATG ATG ACC TTA CCG TT-TAMRA-3'
	DAS-68416-4 (128 bp)	416-1F	5'-TAC TTG CTC TTG TCG TAA GTC AAT AAA TT-3'
		416-1R	5'-GGG CCT AAC TTT TGG TGT GAT G-3'
	DAS-68416-4 (87 bp)	DAS-68416-4-3f5	5'-GTA CAT TAA AAA CGT CCG CAA TGT GT-3'
		DAS-68416-4-3r3	5'-GTT TAA GAA TTA GTT CTT ACA GTT TAT TGT TAG-3'
		DAS-68416-4-3p3	5'-FAM-TTA AGT TGT CTA AGC GTC AAT A-MGB-3'
	SYHT0H2 (140 bp)	FE5313 F	5'-CGC GCA AAC TAG GAT AAA TTA TCG C-3'
		FE08317 R	5'-TGT GTG CCA TTG GTT TAG GGT-3'
	SYHT0H2 (88 bp)	FE08316 fwd	5'-GGG AAT TGG GTA CCA TGC C-3'
		FE08317 rev	5'-TGT GTG CCA TTG GTT TAG GGT-3'
		FE08318 probe	5'-FAM-CCA GCA TGG CCG TAT CCG CAA-BHQ1-3'
	DAS-81419-2 (117 bp)	814-F1	5'-ACA GCA CTT ATT GGT ACT TGT CC-3'
		814-R4	5'-GGA TCA ACA GGC ACC GAT G-3'
	DAS-81419-2 (105 bp)	DAS81419-f2	5'-TCT AGC TAT ATT TAG CAC TTG ATA TTC AT-3'
		DAS81419-r1	5'-GCT TCA AGA TCC CAA CTT GCG-3'
		DAS81419-p3	5'-FAM-ATC AAC AGG CAC CGA TGC GCA CCG-TAMRA-3'
	MON87751 (202 bp)	87751G1	5'-TCG AAC ATT GCA CGA CTC CCA TGA-3'
		87751G2	5'-GGC CTA ACT TTT GGT GTG ATG ATG-3'
	MON87751 (87 bp)	MON 87751 Q1	5'-GGC CTA ACT TTT GGT GTG ATG ATG-3'
		MON 87751 Q2	5'-CTA AAT TGC TCT TTG GAG TTT ATT TTG TAG-3'
		MON 87751 Q3	5'-FAM-TGA CTG GAG ATC TCC AAA GTG AGG GGA AA-TAMRA-3'

* 후대교배종은 후대교배종을 구성하는 이벤트의 프라이머/프로브를 사용하여 검사한다.

표 2. 유전자변형 옥수수의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	이벤트 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	옥수수 SSIIb1 (151 bp)	SSllb 1-5'	5'-CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C-3'
		SSllb 1-3'	5'-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3'
		SSllb-Taq	5'-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-TAMRA-3'
	옥수수 SSIIb3 (114 bp)	SSllb 3-5'	5'-CCA ATC CTT TGA CAT CTG CTC C-3'
		SSllb 3-3'	5'-GAT CAG CTT TGG GTC CGG A-3'
		SSllb-Taq	5'-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A -TAMRA-3'
	옥수수 adh1 (135 bp)	Zm adh1-F	5'-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC-3'
		Zm adh1-R	5'-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC-3'
		Zm adh1-P	5'-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3'
	옥수수 hmg (79 bp)	MaiJ-F2	5'-TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA-3'
		Mhmg-rev	5'-GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T-3'
		Mhmg-probe	5'-FAM-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-TAMRA-3'
스크 리닝	CaMV P35S (101 bp)	P35S 1-5'	5'-ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T-3'
		P35S 1-3'	5'-CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T-3'
		P35S-Taq	5'-FAM-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-TAMRA-3'
	NOS (151 bp)	NOS ter 2-5'	5'-GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3'
		NOS ter 2-3'	5'-CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T-3'
		NOS-Taq	5'-FAM-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-TAMRA-3'
구조 유전자	Bt176 (100 bp)	Bt176 2-5'	5'-TGT TCA CCA GCA GCA ACC AG-3'
		Bt176 2-3'	5'-ACT CCA CTT TGT GCA GAA CAG ATC T-3'
		Bt176-Taq	5'-FAM-CCG ACG TGA CCG ACT ACC ACA TCG A-TAMRA-3'
	Bt11 (127 bp)	Bt11 3-5'	5'-AAA AGA CCA CAA CAA GCC GC-3'
		Bt11 3-3'	5'-CAA TGC GTT CTC CAC CAA GTA CT-3'
		Bt11-Taq	5'-FAM-CGA CCA TGG ACA ACA ACC CAA ACA TCA-TAMRA-3'
	GA21 (133 bp)	GA21 3-5'	5'-GAA GCC TCG GCA ACG TCA-3'
		GA21 3-3'	5'-ATC CGG TTG GAA AGC GAC TT-3'
		GA21-Taq	5'-FAM-AAG GAT CCG GTG CAT GGC CG-TAMRA-3'
	T25 (149 bp)	T25 1-5'	5'-GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA-3'
		T25 1-3'	5'-TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT-3'
		T25-Taq	5'-FAM-TGC AGG CAT GCC CGC TGA AAT C-TAMRA-3'
	MON810 (113 bp)	M810 2-5'	5'-GAT GCC TTC TCC CTA GTG TTG A-3'
		M810 2-3'	5'-GGA TGC ACT CGT TGA TGT TTG-3'
		M810-Taq	5'-FAM-AGA TAC CAA GCG GCC ATG GAC AAC AA-TAMRA-3'
	NK603 (143 bp)	NK603 01-5'	5'-TAT CTT GCT CGA TGC CTT CTC C-3'
		NK603 01-3'	5'-ACA CCA TTG CAG ATT CTG CTA ACT-3'
	NK603 (108 bp)	NK603 primer F	5'-ATG AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA-3'
		NK603 primer R	5'-AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CAC T-3'
		NK603 probe PR	5'-FAM-TGG TAC CAC GCG ACA CAC TTC CAC TC-TAMRA-3'
	TC1507 (103 bp)	TC1507 01-5'	5'-GCT TCA ACA GGG CTG AGT TTG-3'
		TC1507 01-3'	5'-CCC CAC ACA GTT TGG GAT CTA-3'
	TC1507 (58 bp)	MaiJ-F2	5'-TAG TCT TCG GCC AGA ATG G-3'
		MaiY-R3	5'-CTT TGC CAA GAT CAA GCG-3'
		MaiY-S1	5'-FAM-TAA CTC AAG GCC CTC ACT CCG-TAMRA-3'
	MON863 (152 bp)	tahsp17-5‘	5'-GTG TTT TTT GGA TCC CCG G-3'
		MON 3-3‘	5'-CCA TCA TGG TTG GTT GGA CTT-3'
	MON863 (84 bp)	MON863 primer F	5'-GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C-3'
		MON863 primer R	5'-TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT-3'
		MON863 probe	5'-FAM–TGA ACA CCC ATC CGA ACA AGT AGG GTC A-TAMRA-3'
	DAS59122-7 (141 bp)	DAS 5-5‘	5'-GCA CCT GTG ATT GGC TCA TAA A-3'
		Pubi-3‘	5'-CTC CCT TAA TTC TCC GCT CAT G-3'
	DAS59122-7 (84 bp)	DAS-59122-7 rb1f	5'-GGG ATA AGC AAG TAA AAG CGC TC-3'
		DAS-59122-7 rb1r	5'-CCT TAA TTC TCC GCT CAT GAT CAG-3'
		DAS-59122-7 rb1s	5'-FAM-TTT AAA CTG AAG GCG GGA AAC GAC AA-TAMRA-3'
	MON88017 (100 bp)	MON88017-G-5'	5'-GCT AGC TTG ATG GGG ATC AGA TTG-3'
		MON88017-G-3‘	5'-GAT TGG TTT GTT TTC GGC AGT ATG-3'
	MON88017 (95 bp)	MON88017AF	5'-GAG CAG GAC CTG CAG AAG CT-3`
		MON88017AR	5`-TCC GGA GTT GAC CAT CCA-3`
		MON88071AP	5`-FAM-TCC CGC CTT CAG TTT AAA CAG AGT CGG GT-TAMRA-3`
	MIR604 (142 bp)	MIR604-CJB264-5'	5'-TCG CGC GCG GTG TCA TCT ATG-3'
		MIR604es-LB-R-3'	5'-CGC GAC ACA CCT CGT TAG TTA A-3'
	MIR604 (76 bp)	MIR604 primer F	5'-GCG CAC GCA ATT CAA CAG-3'
		MIR604 primer R	5'-GGT CAT AAC GTG ACT CCC TTA ATT CT-3'
		MIR604 probe	5'-FAM-AGG CGG GAA ACG ACA ATC TGA TCA TG-TAMRA-3'
	MON89034 (112 bp)	MON89034-5'	5'-CTC CAT ATT GAC CAT CAT ACT C-3'
		MON89034-3'	5'-GGG TTG AAA TGA AAT TTC CAA TAC-3'
		MON89034-Taq	5'-FAM-ATC CCC GGA AAT TAT GTT-MGBNFQ-3'
	MIR162 (149 bp)	FE02402-5'	5'-GTG GAC TGA AAG GAG ACT TTG TTT ATC-3'
		FE01004-3'	5'-GAT TGT CGT TTC CCG CCT TCA GTT-3'
	MIR162 (92 bp)	MIR162-f1	5'-GCG CGG TGT CAT CTA TGT TAC TAG-3'
		MIR162-r1	5'-TGC CTT ATC TGT TGC CTT CAG A-3'
		MIR162-p1	5'-FAM-TCT AGA CAA TTC AGT ACA TTA AAA ACG TCC GCC A-TAMRA-3'
	DP098140-6 (147 bp)	DP098140-6-5'	5'-TCT CTT TGC TTG GTC TTT CTC TAT CGA-3'
		DP098140-6-3'	5'-CCA AAC GTA AAA CGG CTT GTC C-3'
	DP098140-6 (80 bp)	DP098-f6	5'-GTG TGT ATG TCT CTT TGC TTG GTC TT-3'
		DP098-r2	5'-GAT TGT CGT TTC CCG CCT TC-3'
		DP098-p5	5'-FAM-CTC TAT CGA TCC CCC TCT TTG ATA GTT TAA ACT-TAMRA-3'
	3272 (141 bp)	FE02401-5'	5'-CGA TCG AAT TCA TCA GAC CAG ATT C-3'
		FE01002-3'	5'-CGT GAC TCC CTT AAT TCT CCG CT-3'
	3272 (95 bp)	Event 3272-F	5'-TCA TCA GAC CAG ATT CTC TTT TAT GG-3'
		Event 3272-R	5'-CGT TTC CCG CCT TCA GTT TA-3'
		Event 3272-P	5'-FAM-ACT GCT GAC GCG GCC AAA CAC TG-TAMRA-3'
	MON87460 (85 bp)	MON87460-5'	5'-AGC GTT AGA CGG CTG TCT TTG AG-3'
MON87460-3'		5'-GAT GGG GGG CGT TTC TTT GGA AG-3'
MON87460 (82 bp)	MON87460 1Q	5'-CAC GTT GAA GGA AAA TGG ATT G-3'
	MON87460 2Q	5'-TCG CGA TCC TCC TCA AAG AC-3'
	MON87460-Taq	5'-FAM-AGG GAG TAT GTA GAT AAA TTT TCA AAG CGT TAG ACG GC-TAMRA-3'
	5307 (149 bp)	FE06138	5'-CGC GCG GTG TCA TCT ATG T-3'
		MIC5307es-R21	5'-GGC CCA GGG AAG AGG GTA TAT-3'
	5307 (107 bp)	5307 i3' forward primer	5'-CAT GGC CGT ATC CGC AAT GTG-3'
		5307 i3' reverse primer	5'-TGC ACC CTT TGC CAG TGG-3'
		5307 i3' S2 probe	5'-FAM-ACC ACA ATA TAC CCT CTT CCC TGG GCC AG-TAMRA-3'
	MON87427 (152 bp)	87427-1GB	5'-GCG CGC AAA CTA GGA TAA ATT ATC G-3'
		87427-2GB	5'-CTG CCG CGT TGC AAC TTG CAT GT-3'
	MON87427 (95 bp)	MON87427 primer1	5'-ACG GAA ACG GTC GGG TCA AAT G-3'
		MON87427 primer2	5'-CCA TGT AGA TTT CCC GGT TTT CTC-3'
		MON87427 probe	5'-FAM-TCG GGA CAA TAT GGA GAA AAA GAA AGA G-TAMRA-3'
	DAS40278-9 (144 bp)	DAS40278-9-5'	5'-CCT CTC TAA GCG GCC CAA ACT-3'
		DAS40278-9-3'	5'-ATT CTG GCT TTG CTG TAA ATC GT-3'
	DAS40278-9 (98 bp)	DAS40278-9_5’-f1	5'-CAC GAA CCA TTG AGT TAC AAT C-3'
		DAS40278-9_5’-r3	5'-TGG TTC ATT GTA TTC TGG CTT TG-3'
		DAS40278-9_5’-S1	5'-FAM-AGC TAA CCT TCA TTG TAT TCC G-TAMRA-3'
	DP004114-3 (118 bp)	DP4114-3-F	5'-TTA AAA ACG TCC GCA ATG TG-3'
		DP4114-3-R	5'-CCG CGC TGT TTT CTA GTT TT-3'
	DP004114-3 (90 bp)	08-O-2677	5'-CGT TTG TAG CAC TTG CAC GTA GT-3'
		08-O-2678	5'-GGT AAC CGC TCT TCC AGT TGA A-3'
		08-QP74	5'-FAM-AAG CTT CAA CAC AGA TC-MGB-3'
	MON87411 (112 bp)	87411 primer G1	5'-TAG AGC GGC CGC GTT TAA ACT ATC-3'
		87411 primer G2	5'-ACC AGT TCA ATA GAA AAG TAT GCA CAC-3'
	MON87411 (109 bp)	87411 QF	5'-CTC TGT AAC AGA AAA CAC CAT CTA GAG-3'
		87411 QR	5'-ACA AAA GTG AAC TAG TTC TAG GGT AGA T-3'
		87411 QP	5'-FAM-CCG CGT TTA AAC TAT CAG TGT TTA GAG AAT-TAMRA-3'
	MON 87419 (184 bp)	87419-184G1	5'-GGT CGC TGC CAG GTA TTG ATG TG-3'
		87419-184G2	5'-GAT TCG CTA CCT TAG GAC CGT TAT AG-3'
	MON87419 (97bp)	87419 QF	5'-CGG TCG CTG CCA GGT ATT G-3'
		87419 QR	5'-CAG ACC TCA ATT GCG AGC TTT CT-3'
		87419 QP	5'-FAM-TGT GCG CCA GTC AGC ATC ATC ACA CC-TAMRA-3'
	MON 87403 (175 bp)	87403-175G1	5'-CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG-3'
		87403-175G2	5'-GCT CAA GTG ATA AAT AGG TGG CAA CA-3'
	MON87403 (88bp)	87403 QF	5'-CTT TCT TTT TCT CCA TAT TGA CCA TCA TAC-3'
		87403 QR	5'-TAC TCC GGA ATG AGT GCT CTG TAT C-3'
		87403 QP	5'-FAM-TCA TTG CGA TCC ACA TTT CCC TAC ATG G-TAMRA-3'
	MZHG0JG (154 bp)	FE08186-MZHG-F	5'-ATT AGC TAA CGG CCA GGA TCG-3’
		FE30056-MZHG-R	5'-CAC CGT GAC ATG CTT AGC AAA A-3’
	MZHG0JG (81 bp)	MZHG0JG forward	5'-CAA CTA GCT AGA TTA ATT AAC GCA ATC TG-3’
		MZHG0JG reverse	5'-ATT TGT TTG CAA GGT GTG GGA-3’
		MZHG0JG probe	FAM-TTA AGT TGT CTA AGC GTC AAT TTG-BHQ-1
	VCO-01981-5 (85 bp)	VCO-01981-5 primer F	5'-CCA CTG AAC GTC ACC AAG AAG A-3'
		VCO-01981-5 primer R	5'-GCC GCT ACT CGA GGG ATT TA-3'
	VCO-01981-5 (85 bp)	VCO-01981-5 primer F	5'-CCA CTG AAC GTC ACC AAG AAG A-3'
		VCO-01981-5 primer R	5'-GCC GCT ACT CGA GGG ATT TA-3'
		VCO-01981-5 probe	5'-FAM-CAG TAC TCA AAC ACT GAT AG-MGB-3'
	MZIR098 (147 bp)	FE5524	5'-CGA ACG ATC TCA GAC ACC AAA C-3’
		FE5525	5'-GAC TCC CTT AAT TCT CCG CTC AA-3’
	MZIR098 (73 bp)	MZIR098 forward	5'-ATC TCA GAC ACC AAA CCG AGA TC-3’
		MZIR098 reverse	5'-ACA CCG TTA GGC TAG TGC CAG T-3’
		MZIR098 probe	5'-FAM-CAA GTG ACA GCG AAC GGA GCT GGT TT-BHQ1-3’

* 후대교배종은 후대교배종을 구성하는 이벤트의 프라이머/프로브를 사용하여 검사한다.

검출 대상 유전자	프라이머 쌍	증폭산물 크기	비 고
[콩] 내재성유전자   재조합유전자 (전사개시유전자) 재조합유전자 (전사종결유전자) 재조합유전자 (구조유전자)	Le1n02-5' Le1n02-3' P35S1-5' P35S1-3' NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' RRS 01-5' RRS 01-3'	118 bp   101 bp   151 bp   121 bp	Le1/sense Le1/antisense P35S/sense P35S-pro/antisense tNOS/sense tNOS/antisense CTP4 fromP.hybrida/sense EPSPS/antisense
[옥수수] 내재성유전자   내재성유전자   재조합유전자 (전사개시유전자) 재조합유전자 (전사종결유전자) 재조합유전자 (Bt176 검출용) 재조합유전자 (Bt11 검출용) 재조합유전자 (GA21 검출용) 재조합유전자 (T25검출용) 재조합유전자 (M810검출용) 재조합유전자 (CBH351 1차검출용) 재조합유전자 (CBH351 2차확인용)	SSIIb 1-5' SSIIb 1-3' SSIIb 3-5' SSIIb 3-3' P35S 1-5' P35S 1-3' NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' Bt176 2-5' Bt176 2-3' Bt11 3-5' Bt11 3-3' GA21 3-5' GA21 3-3' T25 1-5' T25 1-3' M810 2-5' M810 2-3' CaM03-5' CBH02-3' Cry9C-5' 35Ster-3'	151 bp   114 bp   101 bp   151 bp   100 bp   127 bp   133 bp   149 bp   113 bp   170 bp   171 bp	zSSIIb/sense zSSIIb/antisense zSSIIb/sense zSSIIb/antisense P35S/sense P35S/antisense tNOS/sense tNOS/antisense cryIA(b)/sense PEPC#9 intron /antisense adh1-1S/sense cryIA(b)/antisense OTP/sense m-epsps/antisense pat/sense t35S/antisense hsp70/sense cryIA(b)/antisense CaM03/sense CBH02/antisense cry9C/sense t35S/antisense
[감자] 내재성유전자     내재성유전자   재조합유전자 (NewLeaf Plus 1차검출용) 재조합유전자 (NewLeaf Plus 2차확인용) 재조합유전자 (NewLeaf Y 1차검출용) 재조합유전자 (NewLeaf Y 2차확인용)	Pss 01n-5'   Pss 01n-3' UGPase01-5' UGPase01-5' p-FMV02-5' PLRV01-3' PLRV-rep1-5' PLRV-rep1-3' p-FMV05-5' PVY02-3' pVY01-5' pVY01-3'	216 bp     111 bp   234 bp   172 bp   225 bp   161 bp	S.tuberosumsucrose synthase/sense 상동/antisense UGPase/sense UGPase/antisense p-FMV/sense PLRV/antisense PLRV/sense PLRV/antisense p-FMV/sense PVY/antisense PVY/sense PVY/antisense

표 4. PCR 반응액의 조성

성 분	Stock 용액 농도	최종 농도(튜브)	1회 분량
DNA polymerase1)	5 U/μL	0.625 U	0.125μL
완충용액	10 x	1 ×	2.5μL
MgCl22)	25 mM	1.5 mM	1.5μL
dNTPs	2.5 mM	200μM	2μL
프라이머	각 25μM	각 0.5μM	0.5μL
주형DNA	20 ng/μL	50 ng	2.5μL
멸균증류수		반응 총액이 25μL가되도록 첨가	15.875μL
전체량			25μL

1)DNA polymerase는 95℃의 고온에서 일정 시간 활성화시켜 사용하는
TaqDNA polymerase를 사용한다.

2)MgCl2농도는 증폭의 특이성과 산출량에 크게 영향을 준다. 보통 1.5～2.5 mM이 주로 이용되며, 일반적으로 Mg
2+이온이 과량인 경우는 비특이적인 PCR 산물이 증가하고, Mg 2+이온이 부족한 경우 PCR 산물의 산출률이 감소한다.

라. 시험조작(PCR)

- 스크리닝 Ⅰ법

각 추출 DNA에 대한 PCR은 2회의 확인시험으로 나누어 아래의 방법으로 실시하며, 1차 확인시험에서는 내재유전자와 전사개시인자 및/또는 전사종결인자에 대하여 PCR을 실시한다. 그 결과 2회 반복 추출 DNA 중 내재성 유전자 특이 PCR 산물이 확인된 DNA에서의 35S 프로모터와 NOS 터미네이터의 검출 결과에 따라 다음의 유전자변형 이벤트에 대한 2차 확인시험을 실시한다.

① 35S 프로모터와 NOS 터미네이터 특이 PCR 산물이 모두 확인된 경우: RRS,　MON89788, A2704-12, DP356043-5, DP305423-1, A5547-127, MON87701, CV127, MON87705, MON87708, MON87769, FG72, DAS-44406-6, DAS-68416-4, SYHTOH2, DAS81419-2, MON87751(이상 콩), Bt176, Bt11, GA21, T25, MON810, NK603, TC1507, MON863, DAS59122-7, MON88017, MIR604, MON89034, MIR162, DP098140-6, 3272, MON87460, 5307, MON87427, DAS-40278-9, DP004114-3, MON87411, MON87419, MON87403, MZHG0JG, VCO01981-5, MZIR098(이상 옥수수)

② 35S 프로모터 특이 PCR 산물만 확인된 경우: MON89788, A2704-12, DP356043-5, DP305423-1, A5547-127, MON87701, CV127, MON87705, MON87708, MON87769, DAS-44406-6, DAS-68416-4, DAS81419-2, MON87751(이상 콩), Bt176, T25, MON810, TC1507, DAS59122-7, DP098140-6, DAS-40278-9, DP004114-3, MON87411, MON87419, MON87403, VCO01981-5(이상 옥수수)

③ NOS 터미네이터 특이 PCR 산물만 확인된 경우: MON89788, DP356043-5, DP305423-1, MON87701, CV127, MON87705, MON87708, MON87769, FG72, DAS-44406-6, DAS-68416-4, DAS81419-2, MON87751(이상 콩), GA21, MIR604, MIR162, DP098140-6, 3272, 5307, DAS-40278-9, MON87419, MON87403, VCO01981-5(이상 옥수수)

④ 35S 프로모터와 NOS 터미네이터 특이 PCR 산물이 모두 확인되지 않은 경우: MON89788, DP356043-5, DP305423-1, MON87701, CV127, MON87705, MON87708, MON87769, DAS-44406-6, DAS-68416-4, DAS-81419-2, MON87751(이상 콩), DP098140-6, DAS-40278-9, MON87419, MON87403, VCO01981-5(이상 옥수수)

- 스크리닝 Ⅱ법(유전자변형 콩에 대해서만 적용한다.)

각 추출 DNA에 대한 PCR은 2회의 확인시험으로 나누어 아래의 방법으로 실시하며, 1차 확인시험에서는 내재성 유전자와 RbcS4 프로모터, NOS 터미네이터, E9 터미네이터, pat 유전자, CV127, DP-305423-1, DP-356043-5에 대하여 PCR을 실시한다. 그 결과 2회 반복 추출 DNA 중 내재성 유전자 특이 PCR 산물이 확인된 DNA에서의 RbcS4 프로모터, NOS 터미네이터, E9 터미네이터, pat 유전자의 검출 결과에 따라 다음의 유전자변형 이벤트에 대한 2차 확인시험을 실시한다.

① RbcS4 프로모터 특이 PCR 산물이 확인된 경우: MON87701, MON87751

②NOS 터미네이터 특이 PCR 산물이 확인된 경우: RRS, FG72, SYHT0H2*(pat 도입유전자특이 PCR 산물이 함께 확인된 경우에만 시험함)

③ E9 터미네이터 특이 PCR 산물이 확인된 경우: MON89788, MON87705, MON87708, MON87769

④ pat 도입유전자 특이 PCR 산물이 확인된 경우: A2704-12, A5547-127, DAS-44406-6, DAS-68416-4, DAS-81419-2, SYHT0H2*(NOS 터미네이터 특이 PCR 산물이 함께 확인된 경우에만 시험함)

1) PCR 반응액의 조제

PCR을 하고자 하는 검체 수에 맞춰 사용하는 튜브의 수를 정하고, 이에 따른 전체 필요량에 여유분을 더하여 전체 PCR 반응액의 양을 정한다. 주형 DNA를 뺀 나머지 성분이 표 4의 PCR 반응액의 조성과 같이 되도록 하여 혼합한다. PCR 반응액은 얼음 위에서 취급하며, PCR용 튜브에 각 22.5μL씩 소분한다. 프라이머를 사용하지 않는 음성대조군에 대해서는 별도로 프라이머를 함유하지 않은 PCR 반응액으로부터 22μL를 분주하고 멸균증류수 0.5μL를 가한다.

2) 주형 DNA의 첨가

분취한 PCR 반응액 22.5μL에 주형 DNA용액 2.5μL를 첨가한다. 주형 DNA의 첨가는 음성대조군, 추출 DNA(20 ng/μL), 양성대조군의 순서로 행한다.

3) PCR 증폭

모든 반응액을 분주한 후 PCR을 실시하는데, PCR의 반응조건은 95℃에서 10분간 방치하여 최초의 변성이 일어나게 한 후, 95℃에서 30초간 변성시키고(denaturation), 60℃에서 30초간 유전자를 결합시키며(annealing), 72℃에서 30초간 신장반응(extension)이 일어나도록 하는 것을 1회로 하여, 40회를 반응시킨다. 이후 72℃에서 7분간 최종 신장반응(elongation)을 하고, 모든 반응이 종료되면 4℃를 유지하도록 설정한다. 이상에서 얻어진 PCR 산물은 바로 전기영동하여 증폭산물을 확인하거나 냉동 보관한다.

표 5. PCR 반응 조건

	온도	시간	cycle 수
초기변성(Initial denaturation)	95℃	10분	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 신장(extension)	95℃ 60℃ 72℃	30초 30초 30초	40 cycles
최종신장(elongation)	72℃	7분	1 cycle
보존	4℃	-	-

주1) 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

마. 전기영동에 따른 결과의 판정

PCR 증폭 결과는 캐필러리(capillary), 아가로스겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아마이드겔(polyacrylamide gel)을 이용한 전기영동 등으로 확인할 수 있으며, 여기에서는 아가로스겔 방법을 제시한다.

1) 영동조의 준비

이 단계에서는 특별하게 멸균한 기구를 이용할 필요는 없으나 오염 등의 위험방지를 위해 실험용 고무장갑을 착용하여 조작한다.

먼저 겔 조제용 틀(gel maker)을 조립한다. 겔의 농도는 전기영동할 DNA의 길이와 아가로스 겔의 종류에 따라 결정한다. 본 실험에서는 전기영동하고자 하는 대상이 검체에서 추출한 DNA와 크기가 100～200 bp 전후의 PCR 증폭산물이므로 이에 적합한 아가로스 겔을 제조사의 설명서를 참고하여 사용한다. 필요량의 아가로스를 칭량하여, 전기영동 완충용액을 넣고 가열하여 아가로스를 녹여 사용한다. 전기영동 완충용액으로는 0.5배 또는 1배의 TAE(Tris-acetate/EDTA) 완충용액 또는 TBE (Tris-borate/EDTA) 완충용액을 사용할 수 있으나, 아가로스 겔의 제조 시 사용된 완충용액과 같은 것을 전기영동과정 및 겔의 염색과정에서도 사용하여야 한다. 또한 200 bp 이하의 작은 크기의 PCR 증폭산물을 전기영동하므로 아가로스는 겔 강도가 높은 것을 사용한다. 아가로스가 충분히 녹아 겔이 균일하게 되면 55℃ 정도로 식혀서 겔 조제용 틀에 넣고 콤(comb)을 끼운 후 30분 가량 방치하여 충분히 겔을 굳힌다. 전(前)염색법의 경우 겔 조제용 틀에 넣기 전에 아가로스겔 100 mL당 5 μL의 에티디움 브로마이드(EtBr) 용액(10 ㎎/mL)을 넣고 잘 혼합하며, 후(後)염색법의 경우 겔 조제 시 에티디움 브로마이드를 넣지 않는다. 겔이 굳으면 겔이 잠기도록 전기영동 완충용액을 부어 콤을 조심스럽게 뺀다. 겔을 전기영동조에 장착하고, 겔의 윗면이 충분히 잠길 정도로 전기영동 완충용액을 채운다.

2) 전기영동

PCR 증폭산물에 1/6배의 염색액(gel loading buffer)을 혼합 후 겔의 각 홈에 시료를 조심스럽게 넣으며, 양끝의 각 홈에는 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(Marker DNA)을 넣는다. 이때 용량은 최대 10μL를 넘지 않도록 한다. 시료를 주입 후, 사용하는 전기영동조의 규격에 맞는 전압에서 전기영동한다. 염색액에 함유된 BPB(Bromophenol Blue)가 겔의 1/2에서 2/3가량 진행하면 전기영동을 멈추고 화상분석기 등을 이용하여 전기영동 결과를 확인한다.

3) 겔의 염색

후(後)염색법의 경우 전기영동 완충용액 100 mL당 5μL의 에티디움 브로마이드(EtBr)용액(10 ㎎/mL)을 넣은 염색액에 영동이 끝난 겔을 즉시 넣은 후, 용기를 진탕기(shaker)에 올려놓고 가볍게 진동시키면서 20～30분 정도 염색한 후 다시 30분 정도 전기영동 완충용액에 넣어 탈색시킨다. 전염색법의 경우 이 조작은 불필요하며 바로 결과를 확인할 수 있다.

[주의사항]

에티디움 브로마이드(Ethidium bromide) 시약은 2중 나선 DNA의 나선 사이에 삽입되는 형광시약으로 강력한 돌연변이원성 물질이므로 취급에 주의해야 한다. 취급 시 반드시 고무장갑을 끼고 마스크를 착용하여야 한다. 폐액은 에티디움 브로마이드 처리용의 기구를 사용하는 것이 좋으나, 그럴 수 없는 경우에는 반드시 활성탄(Activated charcoal) 등으로 처리한 후에 폐기하고 고농도의 경우 처리업자에게 위탁한다.

4) 결과의 확인

화상분석기나 Trans-illuminator에 식품포장용 랩을 깔고, 그 위에 염색이 끝난 겔을 올려놓고 자외선을 조사한다. CCD 카메라에 의한 촬영으로 영동 유형을 확인하며, 표식유전자와 비교하여 목적하는 위치에서 밴드(band)가 얻어졌는지를 확인한 후 결과는 화상데이터로 보존해둔다. 폴라로이드 카메라를 사용할 경우 겔의 사진을 촬영하여 보관한다.

바. 분석 결과의 판정 및 처리

전기영동 결과로부터 목적하는 PCR 증폭산물이 얻어졌는지를 확인한 후 다음과 같이 분석결과를 판정한다.

1) 우선 반응 대조군 중 음성대조군(negative control)인 ㉮ DNA를 함유하지 않는 것과 ㉯ 프라이머를 함유하지 않는 것에서 PCR산물이 검출되지 않음을 확인한 후, 양성대조군(positive control)인 ㉰ 비유전자변형(non-GMO) DNA을 함유한 것에서 내재유전자의 PCR 산물은 검출되나 재조합유전자 PCR 산물은 검출되지 않음과 ㉱ 목적하는 재조합유전자를 함유한 것에서 내재유전자 PCR 산물과 도입된 재조합유전자 PCR 산물이 모두 검출되는지를 확인하여야 하며, 이들 결과 중 어느 하나라도 일치하지 않는 경우에는 재시험을 하여야한다.

2) 2반복 추출 DNA에 대한 PCR 결과 하나 이상의 추출 DNA에서 1차 및 2차 확인 시험에 의해 내재유전자와 도입된 재조합유전자 특이 PCR 산물이 모두 확인된 경우 ‘검출’로 판정하며, 2반복 추출 DNA에 대하여 내재유전자의 PCR 산물은 모두 검출되나 재조합유전자 특이 PCR 산물이 검출되지 않은 경우에는 ‘불검출’로 판정하며, 2반복 모두 내재유전자의 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 유전자추출과정부터 다시 반복 시험한다. 반복시험 결과에서도 내재유전자의 증폭산물이 검출되지 않은 경우 ‘검사불능’으로 판정한다(표 6).

3) ① 유전자변형 이벤트 중 35S 프로모터 및 NOS 터미네이터를 모두 사용하는 것으로는 RRS, SYHTOH2, Bt11, NK603, MON863, MON88017, MON89034, MON87460, MON87427, MZHG0JG, MZIR098이 있고, 35S 프로모터만 사용하는 것으로는 A2704-12, A5547-127, Bt176, T25, MON810, TC1507, DAS59122-7, DP004114-3, MON87411이 있으며, NOS 터미네이터만 사용하는 것으로는 FG72, GA21, MIR604, MIR162, 3272, 5307이 있다.

② 유전자변형 이벤트 중 RbcS4 프로모터를 사용하는 것으로는 MON87701, MON87751이 있고, NOS 터미네이터를 사용하는 것으로는 RRS, FG72, SYHT0H2, E9 터미네이터를 사용하는 것으로는 MON89788, MON87705, MON87708, MON87769가 있으며, pat 유전자를 사용하는 것으로는 A2704-12, A5547-127, DAS-44406-6, DAS-68416-4, DAS-81419-2, SYHT0H2가 있다.

4) 이상과 같이 하여 정성분석에서 ‘검출’로 판정된 경우 구분유통증명서 등의 구비 여부를 확인하여 표시제도 위반 여부를 확인하며, 농산물에 대해서는 정량분석을 실시한다. 다만, 스타링크 옥수수(CBH351)와 같이 식용으로 부적합하다고 평가받은 품목, Bt10 옥수수와 같이 상업적 목적으로 생산되지 않아 조건부 승인받은 품목, 해충 저항성 Bt 쌀과 같이 안전성 평가심사를 받지 않은 품목의 검사인 경우 구분유통증명서의 확인이나 정량분석을 실시하지 않는다.

표 6. 결과판정의 흐름도(예시)

사례	추출 DNA	내재성유전자	구조유전자	GMO 여부 판정
사례 1	추출 1	+	+	검출
	추출 2	+	+
사례 2	추출 1	+	+	검출
	추출 2	+	-
사례 3	추출 1	+	+	검출
	추출 2	-	/
사례 4	추출 1	+	-	불검출
	추출 2	+	-
사례 5	추출 1	+	-	불검출
	추출 2	-	/
사례 6	추출 1	-	/	검사 불능
	추출 2	-	/

+ : 특이적 밴드가 검출됨

- : 특이적 밴드가 검출되지 않음

/ : 실험이 불필요함

1. 한 검체당 추출 2회를 하여 PCR을 하되, 사례 6의 경우 추출 1회를 추가로 실시하여 PCR을 한다.

2. NewLeaf Plus 감자, NewLeaf Y 감자, CBH351 옥수수에 대하여 표 3의 프라이머를사용하여 PCR을 할 경우 프로모터와 종결인자(terminator) 대신 1차 검출용 프라이머를 사용하여 실험한다.