10.1.6 정량시험

가. 분석원리

검체에 존재하는 GMO 정량의 필요성에 의해 PCR에 기초한 많은 방법들이 개발되었는데, 이 중 가장 일반적인 방법은 실시간 PCR (Real-Time PCR)이다. 실시간 PCR을 사용하면 유전자변형 여부에 관계 없이 농작물이 반드시 가지고 있는 내재성 유전자에 대한 재조합 유전자의 존재 비율로부터 검체 중에 재조합체가 얼마나 존재하는지를 상대적으로 측정할 수 있다.

1) 실시간 PCR

PCR이 거듭됨에 따라 증가하는 증폭산물에 프라이머와 프로브가 특이적으로 결합할 때 프로브에서 분리되는 형광물질의 양을 동역학적으로 측정하여 주형 DNA의 양을 산출할 수 있다. TaqMan chemistry를 이용하는 실시간 PCR에는 일반 PCR에서 이용되는 프라이머와 함께 주형 DNA에 상보적 염기서열을 가지면서 형광물질(리포터(reporter)와 소거제(quencher))이 결합된 DNA 프로브(probe, 탐침자), 실시간 PCR 장치 등이 필요하다. 이 프로브가 프라이머에 이어 주형 DNA에 결합하고 DNA polymerase의 5’-nuclease 활성에 의해 가수분해되면 리포터가 소거제(quencher)로부터 분리되어 형광을 발하게 된다. 형광 강도는 PCR 반응횟수에 대해 지수함수(指數關數)적으로 증강한다. 따라서 일정한 형광 강도에 따른 PCR 반응횟수를 비교하여 원래의 DNA 양을 구할 수 있게 된다. 실시간 PCR 장치로는 플레이트(plate) 방식, 캐필러리(capillary) 방식 등이 있다.

나. 프라이머와 프로브(probe)

콩 및 옥수수의 내재성 유전자와 구조 유전자의 복제수(copy number)를 구하는데 사용되는 프라이머와 프로브(probe)는 표 1 및 표2와 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브(probe)를 사용할 수도 있다. 동일한 검체에 대하여 내재성 유전자와 구조유전자의 복제수 측정은 같은 플레이트에서 실시되어야 하며, 유전자변형 이벤트가 혼재하고 있을 수 있어 분석대상이 복수이므로 정성분석 결과 검출된 구조유전자를 대상으로 실시간 PCR을 실시하여 각 이벤트별로 정량하고, 이들을 합산하여 결과를 판정한다.

다. 시험용액의 조제

1) 검량선(Calibration curve) 작성용 표준액

복제수를 아는 유전자변형 작물별 플라스미드 DNA 표준용액 또는 특정 함량의 유전자변형 작물 표준품(certified reference material, CRM)으로부터 추출한 DNA 용액을 검량선 작성용 표준액으로 사용한다. 플라스미드 DNA 표준용액을 사용하는 경우 검량선을 작성하기에 적당한 복제수(예를 들면 웰(well) 또는 캐필러리 당 20, 125, 1,500, 20,000, 250,000 복제수)가 되도록 대장균의 ColE1/TE DNA 용액(5 ng/μL)을 사용하여 희석한 것을 사용한다. 표준품으로부터 추출한 DNA 용액을 사용하는 경우 검량선 작성에 사용되는 희석액을 4종 이상으로 하며, 그 최소값과 최대값 사이에 검체의 복제수가 있어야 한다. 검체의 내재성 유전자나 재조합 유전자의 복제수가 검량선 작성용 표준액의 최대 복제수를 초과하는 경우에는 검량선의 유효범위 내에서 측정될 수 있도록 검체 DNA를 적절히 희석하여 정량분석을 다시 실시한다.또한, 검량선 작성에 플라스미드 DNA 표준용액을 사용하는 경우에 한하여 검체 중 유전자재조합식품 혼입률을 계산할 때 실제 유전자변형 작물에서 추출한 DNA와의 오차값을 보정하기 위하여 반드시 보정계수를 적용하여야 한다. 이때 보정계수는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으며, 기기 제조사 또는 플라스미드 DNA 표준용액 제조사에 별도 문의하여 적용하여야 한다.

2) 정량 PCR용 반응액의 조제

정량 PCR에 사용하는 모든 시약은 실온에서 완전히 녹인 후 교반기를 사용하여 충분히 혼합하고 spin down하여 사용한다. 사용하는 시약은 같은 팁을 사용하여 연속하여 주입하면 피펫 내의 공기가 냉각되기 때문에 2번째부터는 통상의 피펫 조작으로 정확하게 주입되지 않으므로 피펫의 설명서에 쓰인 저온 시험재료를 취급할 경우의 조작법을 숙지하여 사용한다. 또한, Universal PCR Master Mix와 같이 점성이 강한 시약을 다룰 때에는 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지 서서히 버튼을 누른 뒤 조금 더 깊숙이 누른 상태에서 팁을 시약에 담근다. 이후 팁이 액면에 수직이 되게 하여 서서히 시약을 흡입하고, 그 상태에서 다시 피펫의 버튼을 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지만 서서히 눌러 시약을 빼낸 후 다시 서서히 시약을 흡입한다. 분주 시에는 팁을 수직으로 하여 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지만 서서히 시약을 분주하고 팁을 튜브에서 빼낸 후 제거한다.표 1 또는 표 2의 프라이머와 프로브(probe)를 사용하여 PCR용 반응액을 25μL로 할 경우 그 조성은 Universal PCR Master Mix 또는 이와 동등한 시약 12.5μL, 프라이머(각 25μM) 0.5μL, 프로브(probe)(10μM) 0.5μL, 멸균증류수 9μL와 주형 DNA 2.5μL로 이루어진다. 주형 DNA로는 검체 DNA (20 ng/μL) 2.5μL, 검량선 작성용 표준용액 2.5μL, ColE1/TE 용액(5 ng/μL) 또는 멸균증류수 2.5μL가 사용된다. 음성대조군으로 사용되는 ColE1/TE 용액은 미량의 DNA가 비특이적으로 튜브 벽면에 흡착되는 영향을 보정할 수 있다.PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 하나의 DNA에 대하여 플레이트 방식의 경우 3 반복 시험(3 웰(well) 분량의 PCR용 반응액을 조제하여 동일 플레이트에서 시험)을, 캐필러리 방식의 경우 2 반복 시험을 실시하여 측정된 평균값을 구한다.표 1 또는 표 2의 프라이머와 프로브(probe)를 사용하여 PCR용 반응액을 25μL로 할 경우 PCR 반응액은 다음과 같이 조제하며, 그 조성이나 양은 프라이머와 프로브(probe) 또는 실시간 PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약의 사용 매뉴얼을 참고하거나 기기 제조사에 별도 문의하여 적용하여야 한다.

가) 프라이머-프로브 혼합액의 조제프라이머가 각 1.25μM, 프로브(probe)가 0.5μM이 되도록 멸균증류수를 사용하여 희석하고 교반기를 사용하여 잘 혼합한 후 사용한다. 예를 들어 프라이머(각 25μM) 180μL에 멸균증류수 1,620μL를 가하고, 프로브(probe)(10μM) 180μL에 멸균증류수 1,620μL를 가한 것을 혼합하여 총 3,600μL로 조제하고 적정량으로 나누어 -20℃에 보관하여 사용한다.

나) 실시간 PCR 반응액의 조제프라이머-프로브 혼합액과 Universal PCR Master Mix 또는 이와 동등한 시약을 1 : 1.25의 비율로 교반기를 사용하여 잘 혼합한다. PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 플레이트 방식의 경우 하나의 DNA 당 3 웰(well) 분량의 PCR용 반응액을 잉여분을 고려하여 한번에 조제한다.

다) 실시간 PCR 반응액의 분주주형 DNA, 각 검량선 작성용 표준액(프라이머 당 5종), 음성대조군용 시험액(프라이머 당 1종)의 수만큼 500μL 튜브를 준비하고 분주할 주형 DNA 등의 이름을 각각 표기한 후 준비한 각각의 500μL 튜브에 실시간 PCR 반응액을 78.75μL씩 분주한다.

라) 주형 DNA, 각 검량선 작성용 표준액 또는 음성대조군용 시험액의 분주실시간 PCR 반응액을 분주한 튜브에 표기된 주형 DNA (20 ng/μL), 각 검량선 작성용 표준액 또는 음성대조군용 시험액을 8.75μL씩 가하고, 교반기를 사용하여 잘 혼합한 후 spin down 한다. 플레이트 방식의 경우 준비된 PCR 반응액을 96 웰(well) 플레이트에 웰(well) 당 25μL씩 분주한다. 플레이트의 뚜껑을 닫을 때 한쪽으로 기울어지지 않도록 대각선 방향으로 번갈아 잘 닫은 후, 전용 롤러를 사용하여 완전히 웰(well)을 밀폐한다. 웰(well)의 하부를 관찰하여 바닥에 기포가 있을 경우는 플레이트의 가장자리를 가볍게 두드리거나, spin down(96 웰(well) 플레이트용 원심분리기 사용)하여 바닥의 기포를 완전히 제거한다.

라. 시험조작(정량 PCR)

정량 PCR은 실시간 PCR 기기를 이용하여 실시한다. 기기에 플레이트나 캐필러리를 장착하고 분석 프로그램을 작동시켜 검체의 정보를 입력한 후 장치의 덮개 온도(Cover temperature)가 105℃ 정도인 것이 확인되면 반응을 개시한다. 96 웰(well) 플레이트 방식의 PCR 반응 조건은 다음과 같다. 50℃에서 2분간 유지한 후, 95℃에서 10분간 방치하는 고온 개시(hot start)법으로 반응을 시작한다. 95℃에서 30초, 59℃에서 1분을 1회로 하여 총 40회의 증폭 반응을 하고, PCR 반응 종료 후 실험결과를 해석한다. PCR 반응 조건은 사용하는 실시간 PCR 기기에 따라 최적 조건으로 변형하여 사용할 수 있으며, 기기 제조사에 별도 문의하여 적용한다.

마. 검량선의 작성

검체를 정량분석할 때 매번 내재성 유전자와 재조합 유전자에 대해 다음과 같이 각각 검량선을 작성한다. PCR 반응 횟수에 대해 형광 시그널의 증가량(ΔRn)을 표시한 증폭곡선에서 baseline을 3～15 사이클로 하고, 검량선 작성용 표준액의 형광시그널이 지수함수적으로 증폭하고 있는 ΔRn 부위를 선택하여 threshold line(Th. line)을 설정한다. 이때 선택된 Th. line은 음성대조군용 시험액에서 나타날 수 있는 비특이적 증폭곡선과 교차하지 않아야 하며, 검량선 작성용 표준액 중 최소값을 가지는 표준액의 증폭곡선과는 교차하여야 한다.

설정된 Th. line과 검량선 작성용 표준액의 증폭곡선이 교차한 점으로부터 threshold cycle(Ct)값을 구하여 그 평균값을 y축으로 하고, 이미 알고 있는 각각의 검량선 작성용 표준액 복제수를 x축으로 하여 각 Ct 값에 대해 얻어진 근사 직선을 검량선으로 한다. 이때 결정계수(coefficient of determination, R2)는 0.990 이상이어야 한다.

바. 검체의 유전자변형식품 혼입률의 계산

검량선 작성에 이용한 Th. line을 사용하여 검체의 내재성 유전자와 재조합 유전자의 Ct값을 구하고, 이들을 각각의 검량선에 내삽하여 초기 유전자 복제수를 구한다. 검체별로 반복 시험된 초기 유전자 복제수의 평균값을 각각 내재성 유전자 복제수와 재조합 유전자 복제수로 한 후, 다음 식에 따라 해당 유전자변형 이벤트의 혼입률을 구한다. 검량선 작성에 플라스미드 DNA 표준용액을 사용한 경우 보정계수를 적용한다.

1) 표준품으로부터 추출한 DNA 용액을 사용하는 경우

※유전자변형식품혼입률(%)
=	재조합 유전자 복제수	×	100
	내재성 유전자 복제수

2) 플라스미드 DNA 표준용액을 사용하는 경우

※유전자변형식품혼입률(%)
=	재조합 유전자 복제수	×	1	×	100
	내재성 유전자 복제수		보정계수

사. 결과의 판정

2회 반복 추출한 DNA 각각에 대하여 얻은 유전자변형 이벤트 함량의 합을 구하여 그 평균값이 3%를 넘은 검체에 대해서는 기준에 맞지 않는 잘못된 구분유통관리가 이루어져 있을 가능성이 있다고 판단한다.