10.1.7.2 PCR법

가. DNA의 추출

10.1.3. DNA의 추출․정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용하며,10.1.5. 정성분석방법의 정성 PCR 방법에 따라 PCR을 실시하되 다음의 프라이머를 사용한다.

나. CBH351 검출용 프라이머

1) 내재성 유전자를 확인하기 위하여 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한다.

2) CBH351의 1차 검출용 프라이머는 다음과 같다.

F-primer(CaM03-5') : 5'-CCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATA-3'

R-primer(CBH02-3') : 5'-GTA GCT GTC GGT GTA GTC CTC GT-3'

3) CBH351의 2차 확인용 프라이머는 다음과 같다.

F-primer(Cry9C-5') : 5‘-TAC TAC ATC GAC CGC ATC GA-3'

R-primer(35Ster-3') : 5'-CCT AAT TCC CTT ATC TGG GA- 3'

다. 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한 것에서 특이적인 PCR 증폭산물이 검출되고 CBH351 1차 검출용 프라이머를 사용한 것에서 170 bp의 PCR 증폭산물이 검출된 경우, 다시 동일한 DNA 추출액에 대하여 CBH351 2차 확인용 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한다. 이 때 171 bp의 PCR 증폭산물이 확인된 경우 “CBH351 검출”이라고 판정하며, 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “CBH351 검출”이라고 판정된 경우 해당 검체는 “CBH351 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다시 전기영동을 실시하여 PCR 증폭산물을 확인하고, 역시 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 그 추출액에서의 결과를 무시하고 다른 DNA 추출액의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA 추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다. 판정 예시는 표 7과 같다.

사례		1	2	3	4	5	6	7	8	9
추출1	내재유전자 검출결과	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋	－
	1차 검출결과	＋	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	/
	2차 확인결과	＋	＋	＋	＋	/	/	－	－	/
추출2	내재유전자 검출결과	＋	＋	＋	－	＋	－	＋	－	－
	1차 검출결과	＋	＋	－	－	－	－	＋	－	/
	2차 확인결과	＋	－	/	/	/	/	－	/	/
판 정		검출	검출	검출	검출	불검출	불검출	불검출	불검출	/

주1) 사례 9의 경우 3회째 DNA 추출을 실시하여 결과를 판정

주2) ＋는 검출, －는 불검출, /은 검사가 불필요함을 표시