10.1.9 Bt10 옥수수

옥수수 원곡 또는 옥수수 가공식품에 대하여 해충 저항성 및 제초제 내성 유전자변형 옥수수 Bt10을 검출하기 위한 방법이다.

가. DNA의 추출 및 PCR

10.1.3 DNA의 추출․정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용하며, 10.1.5 정성분석방법의 정성 PCR 방법에 따라 PCR을 실시하되 다음의 프라이머를 사용한다.

1) 내재성 유전자를 확인하기 위하여 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한다.

2) Bt10 옥수수 검출용 프라이머는 다음과 같다.

F-primer(JSF5) : 5'-CAC ACA GGA GAT TAT TAT AGG GTT ACT CA-3'

R-primer(JSR5) : 5'-ACA CGG AAA TGT TGA ATA CTC ATA CTC T-3'

나. PCR 증폭산물의 확인

Bt10 옥수수 검출용 프라이머를 사용한 것에서 117 bp의 PCR 증폭산물이 검출된 경우, 위양성결과를 방지하기 위하여 다음과 같이 제한효소 확인시험을 실시한다.

117 bp로 추정되는 검체의 PCR 증폭산물 10μL에SspI(Invitrogen사 제품) 1μL (10 units)와 REACT6 buffer 1μL를 가하여 잘 섞은 후 37℃에서 1시간 반응시킨다. 반응액 10μL와 1/6배의 염색액(gel loading buffer) 2μL를 혼합하고, 그 혼합액 10μL를 3% 아가로스겔에서 염색액에 함유된 BPB가 겔의 약 90% 가량 전개될 때까지 전기영동한다. Bt10 옥수수 추출 DNA를 함유한 양성대조군의 PCR 증폭산물에 대해서도 동일한 조건으로 제한효소를 처리하고 전기영동을 실시한다. 이때 단편의 크기 비교가 용이하도록 양성대조군과 검체를 1조로 하여 아가로스겔에 로딩하며, 표식 DNA(Marker DNA)로는 25/100 bp DNA ladder를 사용한다. 10.1.5 정성분석방법 마. 전기영동에 따른 결과의 판정 3) 겔의 염색 및 4) 결과의 확인에 따라 77 bp와 40 bp의 밴드가 나타나는지를 확인한다.

다. 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한 것에서 특이적인 PCR 증폭산물이 검출되고, Bt10 검출용 프라이머를 사용한 것에서 117 bp의 PCR 증폭산물이 확인되며, 117 bp의 PCR 증폭산물에 대한 제한효소 분해산물이 2개의 DNA 단편으로서 그 크기가 77 bp와 40 bp임이 확인되는 경우 “Bt10 옥수수 검출”이라고 판정한다. 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “Bt10 옥수수 검출”이라고 판정된 경우 해당 검체는 “Bt10 옥수수 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다른 DNA 추출액에서의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA 추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다.