10.1.10해충 저항성 Bt 쌀

쌀 또는 쌀 가공식품에 대하여 해충 저항성 Bt 쌀을 검출하기 위한 방법이다. 최소한 6,000립 또는 200 g 이상을 취하여 분쇄기로 균질하게 분쇄한 것을 분석검체로 사용하며, 10.1.3 DNA의 추출․정제법에 따라 2회반복 추출하여 얻은 DNA 용액에 대하여 10.1.5정성분석방법에 따라 PCR을 실시하되, 쌀 내재성 유전자와 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머를 사용하는 PCR의 온도조건은 표 8과 같다. 쌀 내재성 유전자와 NOS종결인자(terminator)에 대한 프라이머를 사용하여 1차 스크리닝 PCR을 하며, 그 결과가 양성인 경우 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머를 사용하여 확인 PCR을 실시하여 혼입 여부를 판정한다.

가.쌀 내재성 유전자와 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머

1)내재성 유전자를 확인하기 위한 프라이머는 다음과 같으며, 프라이머(12 μM)는 각각 0.12 μM이 되도록 PCR 튜브에 0.25μL씩 가하여 사용한다.

F-primer(OsSPS-F) : 5'-GAT CGG TTC CGC CAT TAG CA-3'

R-primer(OsSPS-R) : 5'-AAC CGA GCG CGA TCA CTT GC-3'

2)해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머는 다음과 같으며, 프라이머(40 μM)는 각각 0.4 μM이 되도록 PCR 튜브에 0.25μL씩 가하여 사용한다.

F-primer(Oscry1Ac-F) : 5'-GCA GGA GTG ATT ATC GAC AG-3'

R-primer(OsNOS-R2) : 5'-AAG ACC GGC AAC AGG ATT CA-3'

나. 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 OsSPS 프라이머를 사용한 것에서 110 bp의 PCR 증폭산물이 검출되고, NOS 종결인자(terminator) 검출용 프라이머를 사용한 것에서 151 bp의 PCR 증폭산물이 확인되며, Oscry1Ac/OsNOS 프라이머를 사용한 것에서 147 bp의 PCR 증폭산물이 확인되는 경우 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 판정한다. 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 판정된 경우 해당 검체는 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다른 DNA 추출액에서의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA 추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다.

	온도	시간	cycle 수
초기 변성(Initial denaturation)	95℃	5분	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 신장(extension)	95℃ 62℃ 72℃	30초 30초 30초	40 cycles
최종신장(elongation)	72℃	8분	1 cycle
보존	4℃	-	-