10.1.11 유전자변형 면화

면화씨(cotton seed) 또는 그 가공식품에 대하여 실시간 PCR 장치를 사용하여 유전자변형 면화를 검출하기 위한 정성 및 정량분석법이다.

가. DNA의 추출

10.1.3 DNA의 추출․정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

나. 시약 및 시액

1) 프라이머와 프로브

유전자변형 면화 분석에 사용되는 프라이머와 프로브는 표 9와 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있다.

2) 실시간 PCR용 반응액의 조제

표 9의 프라이머와 프로브를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25μL로 할 경우 조성은 표 10과 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브 또는 실시간 PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다. 각 PCR 반응 시에는 음성대조군으로서 주형 DNA 대신 멸균증류수를 사용한 것(NTC, no template control)을, 양성대조군으로 비유전자변형(non-GMO) DNA를 함유한 것(동일 작물로서 0%(w/w) 표준시료에서 추출한 DNA 등) 과 검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 것(동일 작물로서 분석 대상 GMO를 포함하는 표준시료에서 추출한 DNA 등)을 시료와 함께 PCR 시험을 한다. PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 하나의 DNA 시료액에 대하여 3 반복 시험(3 웰(well) 분량의 PCR 반응액을 잉여분을 고려하여 한번에 조제하여 동일 플레이트에서 시험)을 실시하여 측정한다.

표 9. 유전자변형 면화의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	이벤트 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열	농도 (nM)
내재성 유전자	면화 (76 bp)	acp1 primer1-5'	5'-ATT GTG ATG GGA CTT GAG GAA GA-3'	150
		acp1 primer2-3'	5'-CTT GAA CAG TTG TGA TGG ATT GTG-3'	150
		acp1 probe-Taq	5'-FAM-ATT GTC CTC TTC CAC CGT GAT TCC GAA -TAMRA-3'	50
구조 유전자	5311) (72 bp)	531 primer1-5'	5'-TCC CAT TCG AGT TTC TCA CGT-3'	150
		531 primer2-3'	5'-AAC CAA TGC CAC CCC ACT GA-3'	150
		531 probe-Taq	5'-FAM-TTG TCC CTC CAC TTC TTC TC-TAMRA-3'	50
	1445 (87 bp)	1445 primer1-5'	5'-GGA GTA AGA CGA TTC AGA TCA AAC AC-3'	150
		1445 primer2-3'	5'-ATC GAC CTG CAG CCC AAG CT-3'	150
		1445 probe-Taq	5'-FAM-ATC AGA TTG TCG TTT CCC GCC TTC AGT TT-TAMRA-3'	50
	15985 (82 bp)	15985 primer1-5'	5'-GTT ACT AGA TCG GGG ATA TCC-3'	150
		15985 primer2-3'	5'-AAG GTT GCT AAA TGG ATG GGA-3'	150
		15985 probe-Taq	5'-FAM-CCG CTC TAG AAC TAG TGG ATC TGC ACT GAA-TAMRA-3'	50
	MON88913 (94 bp)	MON88913 primer1-5'	5'-GGC TTT GGC TAC CTT AAG AGA GTC-3'	500
		MON88913 primer2-3'	5'-CAA ATT ACC CAT TAA GTA GCC AAA TTA C-3'	500
		MON88913 probe-Taq	5'-FAM-AAC TAT CAG TGT TTG ACT ACA T- MGBNFQ2)-3'	100
	LLCotton25 (79 bp)	KVM156 1-5'	5'-CAA GGA ACT ATT CAA CTG AG-3'	400
		KVM155 2-3'	5'-CAG ATT TTT GTG GGA TTG GAA TTC-3'	400
		TM018 probe-Taq	5'-FAM-CTT AAC AGT ACT CGG CCG TCG ACC GC-TAMRA-3'	200
	281/3006 (111 bp)	281 f1-5'	5'-CTC ATT GCT GAT CCA TGT AGA TTT C-3'	350
		281 r2-3'	5'-GGA CAA TGC TGG GCT TTG TG-3'	450
		281s2 probe-Taq	5'-FAM-TTG GGT TAA TAA AGT CAG ATT AGA GGG AGA CAA-TAMRA-3'	175
	GHB614 (120 bp)	SHA007-5‘	5'-CAA ATA CAC TTG GAA CGA CTT CGT-3'	400
		SHA008-3'	5'-GCA GGC ATG CAA GCT TTT AAA-3'	400
		TM072-Taq	5'-FAM-CTC CAT GGC GAT CGC TAC GTT CTA GAA TT-TAMRA-3'	200
	T304-40 (79 bp)	T304-40-5'	5'-AGC GCG CAA ACT AGG ATA AAT T-3'	400
		T304-40-3'	5'-CCT AGA TCT TGG GAT AAC TTG AAA AGA-3'	400
		T304-40-Taq	5'-FAM-TCG CGC GCG GTG TCA TCT ATC TC-TAMRA-3'	200
	GHB119 (90 bp)	GHB119-5'	5'-CCA GTA CTA AAA TCC AGA TCA TGC A-3'	400
		GHB119-3'	5'-GAA ATT GCG TGA CTC AAA TTC C-3'	400
		GHB119-Taq	5'-FAM-CCT GCA GGT CGA CGG CCG AGT AC-TAMRA-3'	200
	COT102 (101 bp)	COT102_3_89F	5'-TCT CCG CTC ATG ATC AGA TTG TC-3'	600
		COT102_3_181R	5'-CAG TAA CAG TAC AGT CGG TGT AGG G-3'	600
		COT102_3_115T	5'-FAM-TCC CGC CTT CAG TTT AAA CTA TCA GTG TTT AAT-TAMRA-3'	150
	MON88701 (84 bp)	MON88701 primer1	5'-CAT ACT CAT TGC TGA TCC ATG TAG A-3'	300
		MON88701 primer2	5'-AGT GTT AAA CAA GTT ATG TTC TAG AGC-3'	300
		MON88701 probe	5'-FAM-TTC CCG GAC ATG AAG CCT TAA TTC AAT-TAMRA-3'	250
	DAS81910-7 (120 bp)	1706-f2	5'-AAG CTT AGG TGA TTT CGA TGA TG-3'	300
		1706-r3	5'-GAC CTC AAT TGC GAG CTT TC-3'	300
		1706-p3	5'-FAM-CAC ACC AAA AGT TAG GCC CG-TAMRA-3'	150
	GHB811 (144 bp)	PRIM0638	5'-CGA ATA GTT CCA TCA ATT TTA TCA TTT ATG-3’	400
		PRIM1870	5'-CGC TTT AAC GTC CCT CAG ATT T-3’	400
		TM2207	5'-FAM-AAG CCT TGA AAC AGA ACA-MGB-3’	200

* 후대교배종은 후대교배종을 구성하는 이벤트의 프라이머/프로브를 사용하여 검사한다.

1)면화 531 검출용 PCR 검사 결과 양성인 경우 별도로 15985 PCR 검사 결과를 확인하여 15985 양성인 경우 “15985 검출”로 판정하고 15985 음성인 경우 “531 검출”로 판정한다.

2)MGBNFQ : Minor groove binding non-fluorescent quencher

표 10. 유전자변형 면화 검사용 실시간 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)1)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	150 nM ~ 600 nM	0.375~1.5
Probe (10 μM)	50 nM ~ 350 nM	0.125~0.875
주형 DNA (20 ng/μL)	100 ng	5
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가
전체량		25

1)Universal Master Mix 또는 이와 동등한 시약을 사용할 수 있다.

다. 시험 조작(실시간 PCR 장치에 의한 정성분석)실시간 PCR은 기기에 플레이트나 캐필러리를 장착하고 분석 프로그램을 작동시켜 시료의 정보를 입력한 후 장치의 덮개 온도(cover temperature)가 105℃ 정도인 것이 확인되면 반응을 개시한다. 96 웰(well) 플레이트 방식의 PCR 반응 조건은 표 11, 12와 같으며, PCR 반응 종료 후 실험결과를 해석한다. PCR 반응 조건은 사용하는 실시간 PCR 기기에 따라 최적 조건으로 변형하여 사용할 수 있으며, 기기 제조사에 별도 문의하여 적용한다.

표 11. 유전자변형 면화 검사에 사용되는 실시간-PCR 반응 조건(531 제외)

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
초기 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	60℃	1분	Yes

표 12. 유전자변형 면화 531 검사에 사용되는 실시간-PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
초기 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	55℃	1분	Yes

라. 정성분석결과의 판정

PCR 결과를 해석하기 위하여 다음과 같은 절차를 수행한다. ㉮ PCR이 완료되면 PCR 반응 횟수(PCR cycle)에 대해 형광 시그널의 증가량(ΔRn)을 표시한 유전자 증폭곡선에서 3 cycles부터 15 cycles까지를 baseline의 범위로 지정하며, ㉯ 분석하고자 하는 유전자의 양성대조군의 증폭곡선이 지수함수적으로 증가하는 부분의 가운데에 threshold line(Th. line)이 위치하도록 하고(이때 선택된 Th. line은 NTC에서 나타날 수 있는 비특이적 증폭곡선과 교차하지 않아야 함), ㉰ 분석하고자 하는 시료의 Ct 값(설정된 Th. line과 시료의 증폭 곡선과의 교차점에서 구해진 PCR cycle)을 구한다. ㉱ 다른 유전자의 양성대조군 증폭곡선들에 대해서도 각각 ㉯ - ㉰항의 작업을 반복하여 Ct 값을 구한다. 이때 NTC의 경우 모든 웰(well)에서 Ct 값이 45여야 한다. 추출 DNA 시료액 별로 3 반복 시험한 결과, 2개 이상의 웰(well)에서 Ct 값이 45 미만이면서 지수함수적인 증폭이 확인되는 경우 해당 DNA 시료액이 양성이라고 판정한다.하나의 시료에 대한 2회 반복 추출 DNA의 PCR 결과, 하나 이상의 추출 DNA에서 내재성 유전자와 재조합유전자가 양성인 경우 ‘유전자변형 면화 검출’로 판정한다. 2회 반복 추출 DNA에서 모두 내재성 유전자는 양성이지만 모든 재조합유전자가 음성인 경우 ‘불검출’로 판정한다. 다만, 2회 반복 추출 DNA에서 모두 내재성 유전자가 음성인 경우에는 DNA 추출 과정부터 다시 반복 시험한다. 반복시험에서도 동일한 결과인 경우 ‘검사불능’으로 판정한다(표 13).

표 13. 결과 판정의 흐름도(예시)

사례	추출 DNA	결과 분석		GMO 여부 판정
		내재성유전자	재조합유전자
사례 1	추출 1	+	+	검출
	추출 2	+	+
사례 2	추출 1	+	+	검출
	추출 2	+	-
사례 3	추출 1	+	+	검출
	추출 2	-	/
사례 4	추출 1	+	-	불검출
	추출 2	+	-
사례 5	추출 1	+	-	불검출
	추출 2	-	/
사례 6	추출 1	-	/	검사 불능*
	추출 2	-	/

+ : 목적 유전자의 증폭이 확인됨

- : 목적 유전자의 증폭이 확인되지 않음

/ : 실험이 불필요함

* 사례 6의 경우 DNA 추출 1회를 추가로 실시하여 PCR을 한다.

마. 실시간 PCR 장치에 의한 정량분석 및 분석결과의 판정

유전자변형 면화의 혼입 판별을 위한 정량분석 및 분석결과의 판정은 10.1.6 정량시험에 따른다.