10.1.12 유전자변형 카놀라

카놀라 또는 그 가공식품에 대하여 실시간 PCR 장치를 사용하여 유전자변형 카놀라를 검출하기 위한 정성 및 정량분석법이다.

가. DNA의 추출

10.1.3 DNA의 추출․정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

나. 시약 및 시액

1) 프라이머와 프로브(probe)

유전자변형 카놀라 검출에 사용되는 프라이머와 프로브(probe)는 표 14와 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브(probe)를 사용할 수도 있다.

2) 실시간 PCR용 반응액의 조제

표 14의 프라이머와 프로브(probe)를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25μL로 할 경우 PCR 반응액 조성은 표 15와 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브(probe) 또는 실시간 PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다. 각 PCR 반응 시에 사용하여야 하는 음성대조군과 양성대조군 등 그 외 사항은 10.1.11 유전자변형 면화 나. 시약 및 시액 2) 실시간 PCR용 반응액의 조제에 따른다.

표 14. 유전자변형 카놀라의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	이벤트 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열	농도 (nM)
내재성 유전자	카놀라 (101 bp)	BncruA 1-5'	5'-GGC CAG GGT TTC CGT GAT-3‘	200
		BncruA 2-3'	5'-CCG TCG TTG TAG AAC CAT TGG-3‘	200
		BncruA-Taq	5'-FAM-AGT CCT TAT GTG CTC CAC TTT CTG GTG CA-TAMRA-3‘	200
구조 유전자	T45 (123 bp)	KVM172-5'	5'-CAA TGG ACA CAT GAA TTA TGC-3‘	400
		MDB599-3'	5'-GAC TCT GTA TGA ACT GTT CGC-3‘	400
		TM026 probe-Taq	5'-FAM-TAG AGG ACC TAA CAG AAC TCG CCG T-TAMRA-3‘	200
	GT73 (108 bp)	GT73 primer1-5'	5'-CCA TAT TGA CCA TCA TAC TCA TTG CT-3‘	150
		GT73 primer2-3'	5'-GCT TAT ACG AAG GCA AGA AAA GGA-3‘	150
		GT73 pribe-Taq	5'-FAM-TTC CCG GAC ATG AAG ATC ATC CTC CTT-TAMRA-3‘	50
	Ms8 (130 bp)	KVM085-5'	5'-GTT AGA AAA AGT AAA CAA TTA ATA TAG CCG G-3‘	400
		HCA048-3'	5'-GGA GGG TGT TTT TGG TTA TC-3‘	400
		TM011probe-Taq	5'-FAM-AAT ATA ATC GAC GGA TCC CCG GGA ATT C-TAMRA-3‘	200
	Rf3 (139 bp)	DPA165-5'	5'-CAT AAA GGA AGA TGG AGA CTT GAG-3‘	400
		KVM084-3'	5'-AGC ATT TAG CAT GTA CCA TCA GAC A-3‘	400
		TM010 probe-Taq	5'-FAM-CGC ACG CTT ATC GAC CAT AAG CCC A-TAMRA-3‘	200
	MON88302 (101 bp)	88302QF	5'-TCC TTG AAC CTT ATT TTA TAG TGC ACA-3‘	450
		88302QR	5'-TCA GAT TGT CGT TTC CCG CCT TCA-3‘	450
		88302QP	5'-FAM-TAG TCA TCA TGT TGT ACC ACT TCA AAC ACT-TAMRA-3‘	200
	DP-073496-4 (84 bp)	09-0-2824	5'-GTT CTT CTC TTC ATA GCT CAT TAC AGT TTT-3‘	600
		09-0-2825	5'-CAA ACC TCC ATA GAG TTC AAC ATC TTA A-3‘	600
		09-QP83 probe	5'-FAM-TTA GTT AGA TCA GGA TAT TCT TG-MGB*-3‘	250
	MS11 (124 bp)	SHA086	5'-CAA GAT GGG AAT TAA CAT CTA CAA ATT G-3’	400
		MDB371	5'-GAA ATC CAT GTA AAG CAG CAG GG-3’	400
		TM280	5'-FAM-CGA CCA TGT ACA TCC TAC CA-MGB-3’	200

* 후대교배종은 후대교배종을 구성하는 이벤트의 프라이머/프로브를 사용하여 검사한다.

표 15. 유전자변형 카놀라 검사용 실시간 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)1)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	150 nM ~ 600 nM	0.375~1.5
Probe (10 μM)	50 nM ~ 250 nM	0.125~0.625
주형 DNA (40 ng/μL)	200 ng	5
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가
전체량		25

1)Universal Master Mix 또는 이와 동등한 시약을 사용할 수 있다.

다. 시험 조작(실시간 PCR 장치에 의한 정성 및 정량분석)

카놀라 PCR 반응 조건은 표 16과 같으며, 그 외 사항은 10.1.11 유전자변형 면화 다. 시험 조작(실시간 PCR 장치에 의한 정성분석) 및 10.1.6 정량시험에 따른다.

표 16. 유전자변형 카놀라 검사에 사용되는 실시간 PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
초기 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	60℃	1분	Yes

라. 분석결과의 판정

유전자변형 카놀라에 대한 분석결과의 판정은 10.1.11 유전자변형 면화 라. 정성분석결과의 판정 및 10.1.6 정량시험 사. 결과의 판정에 따른다.