10.1.13 유전자변형 사탕무, 알팔파(alfalfa)

사탕무, 알팔파 또는 그 가공식품에 대하여 실시간 PCR 장치를 사용하여 유전자변형 사탕무와 알팔파를 검출하기 위한 정성 및 정량분석법이다.

가. DNA의 추출

10.1.3 DNA의 추출․정제법에 따르며, 알팔파의 경우 10.1.3.3 알팔파 DNA 추출법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

나. 시약 및 시액

1) 프라이머와 프로브

유전자변형 사탕무와 알팔파 검출에 사용되는 프라이머와 프로브는 표 17과 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있다.

2) 실시간 PCR용 반응액의 조제

표 17의 프라이머와 프로브를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25μL로 할 경우 PCR 반응액 조성은 표 18, 19와 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브 또는 실시간 PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다. 각 PCR 반응 시에 사용하여야 하는 음성대조군과 양성대조군 등 그 외 사항은 10.1.11 유전자변형 면화 나. 시약 및 시액 2) 실시간 PCR용 반응액의 조제에 따른다.

목 적	이벤트 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열	농도 (nM)
내 재 성 유 전 자	사탕무 (121 bp)	GruA3 F-5'	5'-GAC CTC CAT ATT ACT GAA AGG AAG-3'	150
		GruA3 R-3'	5'-GAG TAA TTG CTC CAT CCT GTT CA-3'	150
		GruD1 probe-Taq	5'-FAM-CTA CGA AGT TTA AAG TAT GTG CCG CTC-TAMRA-3'	100
	알팔파 (127 bp)	pef1-85F-5'	5'-TAC GTC CAA TCC CAA CGC C-3'	450
		pef1-211R-3'	5'-GGC CTT TTG CTG GTA ATC TAC AAA C-3'	450
		pef1-110P-Taq	5'-FAM-ACC GTG ACT GCA GCA TCT CTG GCA-TAMRA-3'	210
구 조 유 전 자	사탕무 H7-1 (110 bp)	H7PLT1-5'	5'-TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T-3'	400
		ZRH7-R2-3'	5'-AAT GCT GCT AAA TCC TGA G-3'	400
		ZRH7-probe-Taq	5'-FAM-AAG GCG GGA AAC GAC AAT CT -TAMRA-3'	200
	알팔파 J101 (121 bp)	J101-F12-5'	5'-CTG ATC TTG TGT CAT AGT TTC AAA CAC TG-3'	450
		J101-R11-3'	5'-GCT TTG GAC TGA GAA TTA GCT TCC A-3'	600
		J101-P11-Taq	5'-FAM-AAC TGA AGG CGG GAA ACG ACA ATC TG-TAMRA-3'	200
	알팔파 J163 (105 bp)	J163-F1-5'	5'-GAG GCT TTG GAC TGA GAA TTA GCT T-3'	450
		J163-R3-3'	5'-CAA GGT CAT CCA AAC TGA AGT GTT C-3'	450
		J163-P1-Taq	5'-FAM-CAC TCG AGC AGG ACC TGC AGA AGC TT-TAMRA-3'	180
	알팔파 KK179 (88 bp)	KK179 primer1	5'-GAA GCT AGC TTG ATG GGG ATC AGA-3'	450
		KK179 primer2	5'-AAA GTA ACT AGG CTA AAG TAA GAT ATC GAA GA-3'	450
		KK179 probe	5'-FAM-AAG AGG TTT TGA AGG CGG GAA ACG ACA-TAMRA-3'	100

표 17. 유전자변형 사탕무, 알팔파의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

* 후대교배종은 후대교배종을 구성하는 이벤트의 프라이머/프로브를 사용하여 검사한다.

표 18. 유전자변형 사탕무 검사용 실시간 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)1)	1 X	12.5
프라이머 (각 10 μM)	150 nM ~ 400 nM	0.375 ~ 1
Probe (10 μM)	100 nM ~ 200 nM	0.25 ~ 0.5
주형 DNA (10 ng/μL)	50 ng	5
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가
전체량		25

1)Universal Master Mix 또는 이와 동등한 시약을 사용할 수 있다.

표 19. 유전자변형 알팔파 검사용 실시간 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)1)	1 X	12.5
프라이머 (각 10 μM)	450 nM ~ 600 nM	1.125 ~ 1.5
Probe (10 μM)	100 nM ~ 210 nM	0.25 ~ 0.525
주형 DNA (20 ng/μL)	100 ng	5
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가
전체량		25

1)Universal Master Mix 또는 이와 동등한 시약을 사용할 수 있다.

다. 시험 조작(실시간 PCR 장치에 의한 정성 및 정량분석)

사탕무의 PCR 반응조건은 표 20과 같고 알팔파의 PCR 반응조건은 표 21과 같으며, 그 외 사항은 10.1.11 유전자변형 면화 다. 시험 조작(실시간 PCR 장치에 의한 정성분석) 및 10.1.6 정량시험에 따른다.

표 20. 유전자변형 사탕무 검사에 사용되는 실시간 PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
초기 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	50 cycles
	60℃	1분	Yes

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
초기 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	60℃	1분	Yes

라. 분석결과의 판정

유전자변형 사탕무 및 알팔파에 대한 분석결과의 판정은 10.1.11 유전자변형 면화 라. 정성분석결과의 판정 및 10.1.6 정량시험 사. 결과의 판정에 따른다. 다만, 사탕무의 경우 PCR cycle 수가 50이므로 모든 NTC의 Ct 값이 50이어야 하며, 추출 DNA 시료액 별로 3 반복 시험한 결과, 2개 이상의 웰(well)에서 Ct 값이 50 미만이면서 지수함수적인 증폭이 확인되는 경우 해당 DNA 시료액이 양성이라고 판정한다.