8.3.55 콜리스틴(Colistin)

1) 시험법 적용범위

축‧수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중 콜리스틴을 1 N 염산(수산물의 경우,0.5% 포름산 함유 5% 메탄올)으로 추출하고 HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance) 카트리지로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품(A와 B의 혼합물)을 50% 메탄올 용액에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 표준용액: 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록1% 포름산 함유 메탄올으로 희석하여 사용한다.

마) 0.5% 포름산 함유 5% 메탄올:1,000 mL 용량플라스크에포름산5 mL를 넣고 5% 메탄올용액을 표시선까지 채운다.

바) HLB 카트리지(6 mL, 200 mg) 또는 이와 동등한 것

사) 기타시약:특급 또는 이와 동등한 것

아) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 축산물

균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고㉠ 1 N염산용액 5 mL를넣어 추출한 후 4℃,12,000G에서 10분간원심분리한다.㉠의 과정을 2회 반복하여상층액을 합하고 이를추출액으로 한다.미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 HLB카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL로유출시켜 버린후, 1%포름산 함유메탄올 4 mL로 용출하여 받는다.이 용액을흔들어 섞어 추출한 후0.2 μmPTFE (polytetrafluoroethylene)멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

나) 수산물

균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 ㉡0.5% 포름산 함유 5% 메탄올 5 mL를넣어 흔들어 섞은후4℃,12,000G에서 10분간 원심분리한다.㉡의 과정을 2회 반복하여상층액을합하고 이를추출액으로 한다.미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨HLB카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL로유출시켜 버린 후, 1%포름산 함유 메탄올 4 mL로 용출하여 받는다.이 용액을흔들어 섞어 추출한 후0.2 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)컬럼:C18(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2)컬럼온도: 40℃

(3) 이동상

(가) 이동상 A:암모늄포메이트:포름산:물(1:2.5:497.5, v/v/v)

(나) 이동상 B:1% 포름산 함유 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	100	0
1.0	100	0
8.0	10	90
9.0	10	90
9.5	100	0
12.0	100	0

(4) 유속: 0.3 mL/분

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization mode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 500℃

(3) Capillary voltage: 3.5 kV

(4) Collision gas: Ar(아르곤)

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	콜리스틴 A (Colistin A)	4.65	Positive	1168.8	585.3	101.0	30
						227.1	20
						569.6	16
2	콜리스틴 B (Colistin B)	4.47	Positive	1154.7	578.4	101.0	30
						202.0	13
						576.5	16

(5) 분석대상물질의
개별조건

※밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 콜리스틴 A(4.65분), 콜리스틴 B(4.47분) 표준품의 크로마토그램(각 0.15 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

콜리스틴(Colistin): 0.01 mg/kg(유(乳))

콜리스틴(Colistin): 0.05 mg/kg(유(乳)를 제외한 축·수산물)