8.3.56 클라노부틴(Clanobutin), 나프타존(Naftazone), 디클로르보스(Dichlorvos)

1) 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중분석대상물질을0.1% 포름산 함유 아세토니트릴으로 추출하고 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다)표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

마) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량 플라스크에포름산1 mL를넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

바) 0.1% 포름산 함유 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL를 넣고 포름산암모늄 0.63g을 넣어 물로 표시선까지 채운다.

사) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화한시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고, 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 8 mL를넣는다. 이를 10분간흔들어 섞은 후4℃에서 2,600G로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를취한다. 잔류물에 다시0.1% 포름산 함유 아세토니트릴7 mL를넣고10분간흔들어 섞은후4℃에서 2,600G로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 헥산 15 mL를 넣고 10분간흔들어 섞고4℃에서 2,600G로15분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃이하에서0.5 mL가 될 때까지질소 농축한 후,농축액에 0.1% 포름산 함유 10 mM 포름산암모늄 수용액:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액 2 mL를넣어 녹인다. 4℃에서 15,000G로 10분간 원심분리 한 후 상층액을 0.45 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼:C18(2.0 mm × 100 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A:0.1% 포름산 함유 10 mM 포름산암모늄 수용액

(나) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
2	95	5
3	5	95
10	5	95
11	95	5
15	95	5

(3) 유속: 0.20 mL/분

(4) 컬럼 온도: 30℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization mode: ESI(positive, negative)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Collision gas: N2(질소)

(4) 분석대상물질의 개별조건

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	나프타존 (Naftazone)	8.04	Positive	215.1	216.1	199.2	13
						143.2	27
						173.3	13
2	디클로르보스 (Dichlotvos)	8.13	Positive	220.0	221.0	109.0	21
						127.2	35
						79.0	13
3	클라노부틴 (Clanobutin)	8.47	Negative	347.1	346.0	260.1	16
						245.1	38
						134.0	54

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

나프타존

디클로르보스

클라노부틴

그림 1. 나프타존(8.04분), 디클로르보스(8.13분), 클라노부틴(8.47분) 표준품의 크로마토그램(각 0.005 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

클라노부틴(Clanobutin): 0.0001 mg/kg

나프타존(Naftazone): 0.0004 mg/kg

디클로르보스(Dichlorvos): 0.001 mg/kg