7.3.2.14스피노사드(Spinosad)
 
  
 가. 시험법 적용범위가금류고기, 알 등 축산물에 적용한다.
 
  
 나. 분석원리시료를 아세토니트릴로 추출하고, 황산마그네슘, 아세트산나트륨을 이용하여정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.
 
  
 다. 장치
 
  
 1) 액체
 크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)
 
  
 라. 시약 및 시액
 
  
 1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급
 
  
 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
 
  
 3) 표준원액 : 스피노신 A 및 스피노신 D 표준품을 각각 아세토니트릴에 녹여 100 mg/L가 되게 하여 갈색병에 보관한다.
 
  
 4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.
 
  
 5) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급
 
  
 마. 시험용액의 조제
 
  
 1) 추출
 균질화한 닭고기에서 추출한 지방 1 g(알은 10 g)을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고지방(닭고기)은 증류수 5 mL와 1% 아세트산 함유 아세토니트릴 10 mL, 알은 아세토니트릴 10 mL를 가한 뒤 1분간 흔들어 섞은 후, 황산마그네슘 6 g과 아세트산나트륨 1.5 g을 차례로 넣어1분간강하게 흔들어 섞는다 .혼합후 추출물을 1,700G로 5분간 원심분리 한다. 상층액 1.5 mL를 2.0 mL 원심분리관에 옮긴 후 불순물 제거를 위한 다중벽 탄소나노튜브(multi-wall carbon nano tubes, 직경 20∼40 nm, 길이 5∼15 ㎛) 6 mg과 황산마그네슘 225 mg을 넣고 10초간 흔들어 섞은 후 1,400G로 5분간 원심분리한다. 정제된 상층액 1 mL를 멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과한 후 갈색 바이알에 옮겨 시험용액으로 한다.
 
  
 바. 시험조작
 
  
 1) 액체크로마토그래프 분석조건
 
  
 가) 컬럼 : C18(3.0 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것
 
  
 나) 컬럼 온도 : 30℃
 
  
 다) 이동상
 
  
 (1) 이동상 A : 아세토니트릴
 
  
 (2) 이동상 B : 0.1% 포름산 함유 물
 
  
 (3) 농도구배조건
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 시간(분)
 
 
     
 
 A(%)
 
 
     
 
 B(%)
 
 
    
 
    
 
     
 
 0.0
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
    
 
     
 
 4.0
 
 
     
 
 100
 
 
     
 
 0
 
 
    
 
    
 
     
 
 5.0
 
 
     
 
 100
 
 
     
 
 0
 
 
    
 
    
 
     
 
 7.0
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
    
 
     
 
 10.0
 
 
     
 
 10
 
 
     
 
 90
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 라) 이동상 유속 : 0.3 mL/분
 
  
 마) 주입량 : 5 μL
 
  
 2) 질량분석기 분석조건
 
  
 가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode
 
  
 나) Capillary Voltage : 3.5 kV
 
  
 다) Collision gas : 아르곤(Ar)
 
  
 라) Cone voltage : 42 V
 
  
 마) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 분석성분
 
 (Compound)
 
 
     
 
 분자량
 
 (MW)
 
 
     
 
 관측질량
 
 (Exact mass)
 
 
     
 
 선구이온
 
 (Precursor ion,m/z)
 
 
     
 
 생성이온(Product ion,m/z)
 
 
     
 
 충돌에너지
 
 (Collision energy, eV)
 
 
    
 
    
 
     
 
 스피노신 A
 
 (Spinosyn A)
 
 
     
 
 731.9
 
 
     
 
 731.4
 
 
     
 
 732
 
 
     
 
 1421)
 
 
     
 
 46
 
 
    
 
    
 
     
 
 98
 
 
     
 
 60
 
 
    
 
    
 
     
 
 스피노신 D
 
 (Spinosyn D)
 
 
     
 
 745.9
 
 
     
 
 745.4
 
 
     
 
 746
 
 
     
 
 1421)
 
 
     
 
 42
 
 
    
 
    
 
     
 
 189
 
 
     
 
 50
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 1)정량이온
 
  
 3) 검량선 작성
 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적값으로 검량선을 작성한다.
 
  
 4) 표준품의 크로마토그램
 
  
 
 
  
 그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.
 
  
 스피노신 A(A : 4.95분), 스피노신 D(B : 5.01분)
 
  
 5) 정량한계
 가) 0.001 mg/kg(알) 나) 0.01 mg/kg(가금류고기(지방))
 
  
 사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 각각의 검량선에 대입하여 스피노신 A와 스피노신 D의 합으로써 스피노사드 함량을 정량한다.
 
  
 아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 스피노신 A와 스피노신 D를 확인한다.