- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.1 일반사항 ▶ 8.2 정성시험법 ▶ 8.2.2 물리·화학적 시험법
8.2.2.2 수산물 중 동물용의약품 동시 다성분 시험법
1) 시험법 적용범위
수산물(어류, 갑각류) 등에 적용한다.
2) 분석원리
균질화한시료에 0.1 M EDTA in 50 mM 아세트산암모늄 완충용액(pH 4.0)으로 산처리후, 80% 아세토니트릴로 추출하고 C18, PSA(Primary Secondary Amine)를 이용하여 정제한후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액:각 표준품을 [표 1]의 용매를 참조하여 조제한 용액을표준원액으로 한다.
라) 혼합표준용액:각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물로 희석하여 사용한다.
마) 0.1 M Na2-EDTA가 함유된 50 mM 아세트산암모늄 완충용액: 1 L 용량플라스크에아세트산암모늄 3.85 g을 넣고 물 0.9 L로 녹인 후 초산으로pH를 4.0으로맞춘다. 여기에 EDTA-나트륨(Na2-EDTA dihydrate) 37.1 g을 넣고녹인 후물로 표시선까지 채운다.
바) 0.1%포름산(formic acid)수용액: 1 L 용량 플라스크에포름산1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.
사) 2 mM포름산 암모늄 수용액: 1 L 용량 플라스크에포름산암모늄 0.126 g을 넣고 아세토니트릴:물(80:20, v/v) 혼합용액으로 녹여 표시선까지 채운다.
아) 2 mM 포름산 암모늄 및 0.1%포름산함유 아세토니트릴:1 L 용량 플라스크에물 1 mL와포름산암모늄 0.126 g을 잘 녹인 다음포름산1 mL를 넣고아세토니트릴로표시선까지 채운다.
자) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
차) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것
표1. 표준원액 조제에 사용되는 용매
| 용매 |
대상 동물용의약품 |
| 메탄올 |
날리딕스산, 노르플록사신, 다노플록사신, 독시싸이클린, 디아베리딘,디플록사신, 린코마이신, 마보플록사신,메벤다졸,메벤다졸아민,5-하이드록시 메벤다졸,미노싸이클린,비치오놀,설파구아니딘,설파독신, 설파디메톡신, 설파디아진,설파메라진, 설파메타진,설파메톡사졸, 설파메톡시피리다진, 설파모노메톡신, 설파퀴녹살린,설파클로르피라진, 설파클로르피리다진, 설파티아졸, 설파페나졸,설피속사졸,세파드록실, 세팔렉신*, 세프티오퍼*,데스후로일세프티오퍼*,스피라마이신*, 시프로플록사신, 에리스로마이신,에토파베이트,m-페네티딘, 엔로플록사신, 오르메토프림,오플록사신,옥소린산,옥시테트라싸이클린, 올레안도마이신, 조사마이신, 클로르테트라싸이클린, 클록사실린 클린다마이신, 키타사마이신,테트라싸이클린, 트리메토프림, 트리클로르폰*, 티아물린, 티아벤다졸,5-하이드록시 티아벤다졸,티암페니콜,틸미코신*,페노뷰카브,페플록사신, 푸마길린,프라지콴텔, 플로르페니콜,플로르페니콜 아민, 플루메퀸 |
| 50% 메탄올 |
데하이드로콜산, 벤질페니실린, 아목시실린, 암피실린, 클로람페니콜 |
※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 대사물질임.
※ 대상 동물용의약품은 1,000 mg/kg 농도의 표준원액 혼합물로 제조하여 1개월간 안정함(단, *표시 물질은 쉽게 분해되므로 실험직전에 만들어서 사용)
5) 시험용액의 조제
균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고, 0.1 M Na2EDTA in 50 mM 아세트산암모늄 완충용액 1 mL를 넣어 산처리 후, 2 mM포름산암모늄 9 mL를넣어5분간흔들어섞은 후4℃에서 10,000G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 PSA 250 mg, C18250 mg이담겨진 50 mL 원심분리관에 취하여 1분간흔들어 섞고, 4℃에서 10,000G로 5분간 원심분리한다. 상층액 중5 mL를취하여 잔류물이 1 mL가 되도록40°C 이하에서질소 농축한다. 농축 후 1 mL를 취하여0.2 μm PVDF (polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
(1) 컬럼: C18(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A: 0.1%포름산수용액
(나) 이동상 B:2 mM포름산암모늄 및 0.1%포름산함유 아세토니트릴
| 시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
| 0.0 |
90 |
10 |
| 1.0 |
90 |
10 |
| 6.0 |
60 |
40 |
| 10.0 |
5 |
95 |
| 15.0 |
5 |
95 |
| 15.1 |
90 |
10 |
| 20.0 |
90 |
10 |
(3) 유속: 0.3 mL/분
(4) 컬럼온도: 40℃
(5) 주입량: 5 μL
나) 질량분석기 조건
(1) Ionization mode:ESI(Positive, Negative)
(2) Capillary temperature:500℃
(3) Capillary voltage:3.8 kV(Positive), 2.6 kV(Negative)
(4) Collision gas:Ar(아르곤)
(5)분석대상물질의 개별조건
| 연번 |
분석성분 (Compound) |
머무름 시간 (분) |
이온화(Ionization mode) |
관측질량 (Exact mass) |
선구이온 (Precusor ion,m/z) |
생성이온 (Product ion,m/z) |
충돌에너지 (Collision energy, eV) |
| 1 |
날리딕스산 (Nalidixic acid) |
6.77 |
Positive |
232.08 |
233 |
104 187 215 |
36 25 12 |
| 2 |
노르플록사신 (Norfloxacin) |
3.27 |
Positive |
319.13 |
320 |
233 276 302 |
20 15 20 |
| 3 |
다노플록사신 (Danofloxacin) |
3.56 |
Positive |
357.14 |
358 |
231 314 340 |
30 15 20 |
| 4 |
데하이드로콜산 (Dehydrocholic acid) |
7.41 |
Negative |
401.10 |
401 |
215 249 331 |
30 32 23 |
| 5 |
독시싸이클린 (Doxycycline) |
5.05 |
Positive |
444.15 |
445 |
267 321 428 |
34 29 16 |
| 6 |
디아베리딘 (Diaveridine) |
2.83 |
Positive |
260.13 |
261 |
81 123 245 |
40 25 28 |
| 7 |
디플록사신 (Difloxacin) |
4.21 |
Positive |
399.13 |
400 |
299 356 382 |
25 20 20 |
| 8 |
린코마이신 (Lincomycin) |
2.76 |
Positive |
406.21 |
407 |
126 172 359 |
30 20 18 |
| 9 |
마보플록사신 (Marbofloxacin) |
3.11 |
Positive |
362.13 |
363 |
72 320 345 |
20 15 20 |
| 10 |
메벤다졸 (Mebendazole) |
6.46 |
Positive |
295.09 |
296 |
104 165 264 |
30 40 20 |
| 10-1 |
메벤다졸 아민 (Mebendazole amine) |
4.51 |
Positive |
237.09 |
238 |
105 133 160 |
25 30 25 |
| 10-2 |
5-하이드록시 메벤다졸 (5-hydroxy mebendazole) |
4.50 |
Positive |
297.11 |
298 |
79 160 266 |
35 35 20 |
| 11 |
미노싸이클린 (Minocycline) |
3.02 |
Positive |
457.18 |
458 |
283 352 441 |
43 28 15 |
| 12 |
벤질페니실린 (Benzylpenicillin, Penicillin G) |
6.58 |
Positive |
334.09 |
335 |
114 160 176 |
30 15 15 |
| 13 |
비치오놀 (Bithionol) |
10.4 |
Negative |
354.90 |
355 |
161 163 194 |
28 28 25 |
| 14 |
설파구아니딘 (Sulfaguanidine) |
1.13 |
Positive |
214.05 |
215 |
60 92 156 |
12 10 5 |
| 15 |
설파독신 (Sulfadoxine) |
5.00 |
Positive |
310.07 |
311 |
92 108 156 |
28 24 16 |
| 16 |
설파디메톡신 (Sulfadimethoxine) |
5.96 |
Positive |
310.07 |
311 |
92 108 156 |
28 26 18 |
| 17 |
설파디아진 (Sulfadiazine) |
2.63 |
Positive |
250.05 |
251 |
92 108 156 |
26 22 14 |
| 18 |
설파메라진 (Sulfamerazine) |
3.33 |
Positive |
264.06 |
265 |
92 108 156 |
24 22 16 |
| 19 |
설파메타진 (Sulfamethazine) |
3.87 |
Positive |
278.08 |
279 |
92 124 186 |
28 22 16 |
| 20 |
설파메톡사졸 (Sulfamethoxazole) |
5.02 |
Positive |
253.05 |
254 |
92 108 156 |
26 20 14 |
| 21 |
설파메톡시피리다진 (Sulfamethoxypyridazine) |
3.97 |
Positive |
280.06 |
281 |
92 108 156 |
30 25 14 |
| 22 |
설파모노메톡신 (Sulfamonomethoxine) |
4.45 |
Positive |
280.06 |
281 |
92 108 156 |
28 24 16 |
| 23 |
설파퀴녹살린 (Sulfaquinoxaline) |
5.98 |
Positive |
300.06 |
301 |
92 108 156 |
22 22 17 |
| 24 |
설파클로르피라진 (Sulfachlorpyrazin,Sulfaclozine) |
4.66 |
Positive |
284.01 |
285 |
92 108 156 |
26 24 14 |
| 25 |
설파클로르피리다진 (Sulfachlorpyridazine) |
5.85 |
Positive |
284.01 |
285 |
92 108 156 |
24 22 14 |
| 26 |
설파티아졸 (Sulfathiazole) |
2.91 |
Positive |
255.01 |
256 |
92 108 156 |
24 22 15 |
| 27 |
설파페나졸 (Sulfaphenazole) |
6.08 |
Positive |
314.08 |
315 |
92 158 160 |
34 28 22 |
| 28 |
설피속사졸 (Sulfisoxazole) |
5.33 |
Positive |
267.06 |
268 |
92 113 156 |
31 16 14 |
| 29 |
세파드록실 (Cefadroxil) |
1.60 |
Positive |
363.08 |
364 |
114 208 |
15 10 |
| 30 |
세팔렉신 (Cefalexin) |
3.14 |
Positive |
347.09 |
348 |
106 158 174 |
26 10 14 |
| 31 |
세프티오퍼 (Ceftiofur) |
5.57 |
Positive |
523.02 |
524 |
95 125 241 |
42 58 16 |
| 31-1 |
데스후로일세프티오퍼 (Desfuroylceftiofur) |
4.55 |
Positive |
429.02 |
430 |
128 259 368 |
25 18 15 |
| 32 |
스피라마이신 (Spiramycin) |
4.55 |
Positive |
842.51 |
422 |
101 142 174 |
12 10 18 |
| 33 |
시프로플록사신 (Ciprofloxacin) |
3.40 |
Positive |
331.13 |
332 |
204 231 245 |
53 35 19 |
| 34 |
아목시실린 (Amoxicillin) |
1.39 |
Positive |
365.10 |
366 |
113 133 349 |
19 31 5 |
| 35 |
암피실린 (Ampicillin) |
3.12 |
Positive |
349.11 |
350 |
79 106 114 |
44 17 30 |
| 36 |
에리스로마이신 (Erythomycin) |
6.16 |
Positive |
733.46 |
734 |
82 158 576 |
35 25 18 |
| 37 |
에토파베이트 (Ethopabate) |
5.84 |
Positive |
237.10 |
238 |
136 164 206 |
25 20 10 |
| 37-1 |
m-페네티딘 (m-phenetidine) |
3.04 |
Positive |
137.08 |
138 |
65 93 110 |
20 25 10 |
| 38 |
엔로플록사신 (Enrofloxacin) |
3.71 |
Positive |
359.16 |
360 |
189 245 286 |
40 23 32 |
| 39 |
오르메토프림 (Ormethoprim) |
3.48 |
Positive |
274.14 |
275 |
81 123 259 |
43 25 27 |
| 40 |
오플록사신 (Ofloxacin) |
3.29 |
Positive |
361.14 |
362 |
221 261 318 |
35 28 15 |
| 41 |
옥소린산 (Oxolinic acid) |
5.45 |
Positive |
261.06 |
262 |
129 160 173 |
35 28 17 |
| 42 |
옥시테트라싸이클린 (Oxytetracycline) |
3.41 |
Positive |
460.14 |
461 |
201 337 426 |
18 40 28 |
| 43 |
올레안도마이신 (Oleandomycin) |
5.83 |
Positive |
687.41 |
688 |
116 158 544 |
40 25 15 |
| 44 |
조사마이신 (Josamycin) |
7.59 |
Positive |
827.46 |
828 |
83 109 174 |
40 45 34 |
| 45 |
클로람페니콜 (Chloramphenicol) |
5.61 |
Negative |
322.01 |
321 |
152 194 257 |
18 12 10 |
| 46 |
클로르테트라싸이클린 (Chlortetracycline) |
4.77 |
Positive |
478.11 |
479 |
98 154 444 |
40 24 22 |
| 47 |
클록사실린 (Cloxacillin) |
7.89 |
Positive |
435.06 |
436 |
159 178 321 |
10 20 15 |
| 48 |
클린다마이신 (Clindamycin) |
4.98 |
Positive |
424.17 |
426 |
126 335 377 |
25 18 15 |
| 49 |
키타사마이신 (Kitasamycin) |
6.93 |
Positive |
701.40 |
772 |
83 109 174 |
45 38 30 |
| 50 |
테트라싸이클린 (Tetracycline) |
3.72 |
Positive |
444.15 |
445 |
154 225 410 |
24 50 16 |
| 51 |
트리메토프림 (Trimethoprim) |
3.18 |
Positive |
290.13 |
291 |
123 230 261 |
30 18 25 |
| 52 |
트리클로르폰 (Trichlorfon) |
4.28 |
Positive |
255.92 |
259 |
79 109 223 |
25 18 10 |
| 53 |
티아물린 (Tiamulin) |
6.91 |
Positive |
493.32 |
494 |
73 119 192 |
50 40 20 |
| 54 |
티아벤다졸 (Thiabendazole) |
2.72 |
Positive |
201.04 |
202 |
92 131 175 |
30 25 25 |
| 54-1 |
5-하이드록시 티아벤다졸 (5-hydroxy thiabendazole) |
1.91 |
Positive |
217.03 |
218 |
81 108 147 |
35 30 25 |
| 55 |
티암페니콜 (Thiamphenicol) |
3.70 |
Positive |
355.00 |
354 |
185 240 290 |
20 16 12 |
| 56 |
틸미코신 (Tilmicosin) |
5.39 |
Positive |
868.56 |
870 |
88 126 174 |
60 55 45 |
| 57 |
페노뷰카브 (Fenobucarb) |
8.63 |
Positive |
207.13 |
208 |
57 95 152 |
15 15 5 |
| 58 |
페플록사신 (Pefloxacin) |
3.34 |
Positive |
333.14 |
334 |
233 290 316 |
23 16 18 |
| 59 |
푸마길린 (Fumagillin) |
9.27 |
Positive |
458.23 |
459 |
131 177 233 |
25 15 12 |
| 60 |
프라지콴텔 (Praziquantel) |
8.12 |
Positive |
312.18 |
313 |
83 174 203 |
22 28 14 |
| 61 |
플로르페니콜 (Florfenicol) |
5.14 |
Negative |
357.00 |
356 |
118 185 336 |
40 21 13 |
| 61-1 |
플로르페니콜아민 (Florfenicol amine) |
1.11 |
Positive |
247.06 |
248 |
91 130 230 |
42 25 10 |
| 62 |
플루메퀸 (Flumequine) |
7.03 |
Positive |
261.08 |
262 |
99 126 202 |
54 44 30 |
※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
7)정성 및 확인시험
가) 정성 및 확인
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료
(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.
주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
| 이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %) |
허용범위 |
| > 50% |
± 20% |
| > 20%, ≤ 50% |
± 25% |
| > 10%, ≤ 20% |
± 30% |
8) 정량시험
가) 정성 및 확인시험에서 검출된 잔류동물용의약품은 아래 나)항(다)항에서 정량한계가제시된 물질에 한함)에 따르거나식품공전 8.3의 정량시험법에 따라 정량한다. 단, 부적합 판정은 8.3의 정량시험법에 의한 결과가 우선한다.
나) 다)의 정량이 가능한 동물용의약품(정량한계 표시)의 경우,조직표준곡선(tissuestandard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blanksample) 2 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을제조한다. 각 농도별 첨가시료에서얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도, 시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여정량한다.
다) 정량한계
| 구분 |
정량한계 |
|||
| 계열 |
동물용의약품 |
넙치 |
장어 |
새우 |
| 린코사마이드계 |
린코마이신 |
0.001 |
0.001 |
- |
| 클린다마이신 |
0.005 |
0.005 |
- |
|
| 마크로라이드계 |
스피라마이신 |
- |
- |
- |
| 에리스로마이신 |
0.001 |
0.001 |
- |
|
| 올레안도마이신 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| 조사마이신 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 틸미코신 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| 키타사마이신 |
- |
- |
- |
|
| 벤조이미다졸계 |
메벤다졸 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
| 메벤다졸 아민 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| 5-하이드록시 메벤다졸 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| 티아벤다졸 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| 5-하이드록시 티아벤다졸 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| 설파계 |
설파구아니딘 |
0.005 |
0.005 |
0.005 |
| 설파독신 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파디메톡신 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파디아진 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파메라진 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파메타진 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파메톡사졸 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파메톡시피리다진 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파모노메톡신 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파퀴녹살린 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파클로르피리다진 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파클로르피라진 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파티아졸 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설파페나졸 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 설피속사졸 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 세팔로스포린계 |
세파드록실 |
0.001 |
0.001 |
- |
| 세팔렉신 |
0.005 |
0.005 |
0.005 |
|
| 세프티오퍼 |
- |
- |
- |
|
| 데스후로일세프티오퍼 |
- |
- |
- |
|
| 퀴놀론계 |
날리딕스산 |
0.0001 |
0.0001 |
0.0001 |
| 노르플록사신 |
0.0007 |
0.0007 |
0.0007 |
|
| 다노플록사신 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| 디플록사신 |
0.001 |
- |
- |
|
| 마보플록사신 |
0.0001 |
0.0001 |
0.0001 |
|
| 시프로플록사신 |
0.0001 |
0.0001 |
0.0001 |
|
| 엔로플록사신 |
0.0001 |
0.0001 |
0.0001 |
|
| 오플록사신 |
0.0002 |
0.0002 |
0.0002 |
|
| 옥소린산 |
0.0001 |
- |
0.0001 |
|
| 페플록사신 |
0.0007 |
0.0007 |
0.0007 |
|
| 플루메퀸 |
- |
- |
- |
|
| 테트라싸이클린계 |
독시싸이클린 |
0.005 |
0.005 |
0.005 |
| 옥시테트라싸이클린 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 클로르테트라싸이클린 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 테트라싸이클린 |
0.001 |
- |
0.001 |
|
| 미노싸이클린 |
0.01 |
- |
0.01 |
|
| 페니실린계 |
벤질페니실린 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
| 아목시실린 |
0.005 |
- |
- |
|
| 암피실린 |
0.005 |
0.005 |
0.005 |
|
| 클록사실린 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| 페니콜계 |
플로르페니콜 |
- |
- |
- |
| 플로르페니콜아민 |
- |
- |
- |
|
| 티암페니콜 |
- |
- |
- |
|
| 클로람페니콜 |
- |
- |
- |
|
| 기타 |
데하이드로콜산 |
0.005 |
0.005 |
0.005 |
| 디아베리딘 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| 비치오놀 |
- |
- |
- |
|
| 에토파베이트 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| m-페네티딘 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
|
| 오르메토프림 |
- |
- |
- |
|
| 트리메토프림 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 트리클로르폰 |
0.001 |
0.001 |
- |
|
| 티아물린 |
0.001 |
0.001 |
- |
|
| 페노뷰카브 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
| 푸마길린 |
- |
- |
- |
|
| 프라지콴텔 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
|
※ 정성만 가능한 물질은 ‘-’로 표시
