- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 2. 식품성분시험법 ▶ 2.1 일반성분시험법 ▶ 2.1.3 질소화합물 ▶ 2.1.3.2 아미노산질소
2.1.3.2 아미노산질소
가. 반슬라이크(Van Slyke)법
1) 장치
반슬라이크(Van Slyke)법 장치 일부 확대 그림
A：약 35 mL의 핀치콕크가 달린 깔때기
B：아미노산을 분해시키는 용기(용량 40～45 mL)
C：용량 10 mL의 뷰렛
D：가스뷰렛
E：헨펠가스피펫
F：수준조
A와 B를 연결하는 관의 안지름과 핀치콕크 a의 구멍지름은 3 mm이며, 핀치콕크 b의 구멍지름은 될 수 있으면 큰 것이 좋다. B와 C의 접속부는 안지름이 8 mm이상, 핀치콕크 c의 구멍지름은 1 mm, d의 구멍지름은 1.5～2 mm로 하여야 하고 A, B 및 C에 있어서의 각 핀치콕크는 아라비아검․파라핀․와세린(1：1：2)을 혼합한 것을 발라 A와 B가 움직일 때에 가스가 새지 않도록 해야 한다.
2) 시약 및 시액
알칼리성 과망간산칼륨용액∶포화과망간산칼륨용액 1 L에 수산화칼륨 또는 수산화나트륨 25 g을 가하여 녹인다.
3) 시험용액의 조제
검체가 고체인 경우에는 그 일정량을 취하여 약 10배량의 물을 가해서 1시간 냉침한 후 흡인여과하고 다시 1회 침출을 되풀이 하고 잔류물은 다시 일회 처음과 같은 양의 물과 함께 끓인 후 여과하고 여액을 합해서 다시 끓여 단백질을 응고시킨다.
다음에 여과 세정하고 여액 및 세액을 합하여 증발시켜서 소량으로 하고 이에 약 5%가 되도록 10% 황산을 가한 후 인텅스텐산용액을 가해 침전이 생기면 여과하고 이어서 5% 황산으로 세척하여 여액에 세액을 합한 후 물로써 일정량으로 하여 시험용액으로 한다.
검체가 액체인 경우에는 그 일정량을 취하여 끓여서 침전이 생성되면 여과하고 위와 같은 10% 황산을 가하여 약 5%로 하고 다시 인텅스텐산용액을 가하여 침전이 생기면 이를 여과하고 여액을 일정량으로 해서 시험용액으로 한다.
이 시험용액에 대하여 염산 7～8 mL 또는 황산 2～2.5 mL를 가해서 1.5～2시간 끓인 다음 석회유, 산화마그네슘 또는 알칼리에 가해 증발 건조시켜서 암모니아를 날려 보낸다. 잔류물을 끓인 물에 녹이고 필요하면 여과한다. 이 액은 분해가 쉽게 되므로 신속하게 시험하여야 한다.
4) 시험방법
가) 장치내의 공기제거
D로부터 물을 작은 관 d 및 g까지 채우고 다음에 A1의 표선(B의 용량의 1/5에 상당한다)까지 초산을 넣고 핀치콕크 a와 b를 열어서 B로 옮긴다. 다음에 30%(w/v) 아질산나트륨용액을 A2에 넣고 전과 같은 조작으로 이것을 B중에 흘려 넣어서 B에 완전히 채우는 한편 그 소량은 A내로 남긴다.
다시 d를 막고 a를 열어 수초간 흔들어 NO가 발생해서 B의 상부에 모인다. d를 열어서 이를 i에 배제한 후, d를 막고 다시 B를 흔들어 발생하는 NO를 같은 방법으로 배치한다. 이 조작을 반복하여 협잡하는 공기를 완전히 제거한 후 B를 진동장치(H)에 연결하고 진동시켜 B중의 용액의 액면이 표선 20 mL가량 내려가면 핀치콕크 a를 닫고 핀치콕크 d 및 e를 열어 B와 D를 연결시킨다.
나) 반응
아미노산의 시험용액을 C에 넣고 c를 열어 그 소요량을 B중에 유입시키고 c를 막은 다음 흔들면 발생하는 N2가 NO와 함께 D내에 모인다. 만약 거품이 생길 경우에는 적당량의 아밀알코올(amyl alcohol)을 C로부터 B중에 첨가한다. 반응은 2～5분간에 끝난다. 다음에 이를 열어서 A중의 액을 B중에 흘려 넣어 B중의 가스를 전부 D내로 이행시킨다.
다) 질소(N)량의 측정
D중에 모인 가스를 알칼리성 과망간산칼륨용액을 가득 채운 헴펠가스피펫 E에 옮겨 진동장치를 연결하여 진동시켜서 협잡하는 NO를 흡수시킨 후 남은 N2를 재차 D내에 옮겨 그 양을 읽고 이것을 부표에서 찾아 N2의 양을 구하고 이를 1/2로 하여서 아미노산성질소의 총량으로 한다.
나. 홀몰적정법(Sörensen법)
1) 분석원리
양성 전해질인 아미노산의 아미노가 또는 카르복실기의 산 또는 알칼리적정에 의한 정량은 그 수용액이 완충성을 가지고 있다는 점과 아미노기 또는 카르복실기의 적정반응 종말점이 거의 pH 11 및 1.5여서 적당한 지시약이 없다는 점 때문에 보통의 적정으로서는 불가능하다.
그러나 아미노산의 중성 또는 약알칼리성의 용액에 포름알데히드를 가하여 하이드록실메틸 유도체를 생성하여 아미노기의 질소원자의 염기성이 현저히 적어지기 때문에 알칼리에 의한 아미노기의 적정 종말점이 pH 9부근으로 옮겨진다.
따라서 포름알데히드의 존재하에서 페놀프탈레인을 지시약으로 하여 알칼리로 적정함으로써 아미노산을 정량할 수 있다.
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HCHO |
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HCHO |
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| R‧CH‧COO- |
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――→ |
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R‧CH‧COO- |
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――→ |
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R‧CH‧COO- |
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| ＋NH3 |
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＋NH2CH2OH |
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CH2OH ＋NH＜ CH2OH |
| OH-(알칼리적정) |
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R‧CH‧COO- |
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CH2OH N＜ CH2OH |
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2) 시약 및 시액
가) 비교액
제일인산칼륨 9.078 g 및 제이인산나트륨 11.876 g을 각각 물에 녹여 1 L로 한다. 쓸 때에 양 액을 같은 양으로 섞어서 만든다(pH 6.8).
나) 중화홀몰액
30～40% 포름알데히드 50 mL에 페놀프탈레인용액(0.5%) 1 mL를 가한 다음 엷은 홍색이 될 때까지(pH 8.3) 0.2 N 수산화나트륨액을 가한다.
다) 대조액
끓여서 식힌 물 20 mL에 중화홀몰액 10 mL, 페놀프탈레인용액 1 mL 및 적정소요량의 약 1/2가량의 0.2 N 수산화나트륨액을 가한 다음 액이 엷은 홍색을 나타낼 때까지 0.2 N 염산을 적하한다(pH 8.3 제1기). 다음에 0.2 N 수산화나트륨액 5방울을 가하여 명확하게 홍색으로 한다(pH 8.8 제2기).
3) 시험용액의 조제
인산, 탄산 및 다량의 암모늄염을 함유하지 않은 검체에 대해서는 묽은 염산 또는 수산화나트륨용액으로 pH 6.8로 조절한다(비교액을 동시에 청색 리트머스지상에 적하하여 그 정색도를 일치시킨다). 인산 또는 탄산을 함유한 검체는 그 50 mL를 100 mL의 메스플라스크에 취하여 페놀프탈레인용액 1 mL 및 염화바륨 2 g을 넣고 흔들어 녹인 후 지시약이 정색될 때까지 포화수산화바륨용액을 가한다. 다시 포화수산화바륨용액 5 mL를 추가하고 물을 가하여 100 mL로 하고 잘 섞어서 15분간 방치한다.
이어서 건조여과지로 여과하고 그 여액 80 mL를 100 mL의 메스플라스크에 취하고 0.2 N 염산으로 중화시켜 탄산이 없는 물을 가하여 100 mL로 해서 시험용액으로 한다.
암모늄염을 0.02 M 이상 함유한 검체는 위의 수산화바륨처리를 한 여액 80 mL를 취하여 감압증류를 하여 암모니아를 제거하고 1N 염산 수 mL를 가하고 탄산가스를 함유하지 아니한 공기를 통하여 탄산가스를 제거하고 중화하여 일정용량으로 한다.
4) 시험방법
가) 적정
시험용액 20 mL 중화홀몰액 10 mL 및 페놀프탈레인용액 1 mL를 가하고 대조액보다 조금 진하게 정색될 때까지 0.2 N 수산화나트륨액을 가한 다음 0.2 N 염산으로 대조액보다 약하게 정색시킨다.
다음 0.2 N 수산화나트륨액을 적가하여 대조액(제2기)과 같은 색이 되도록 한다. 대조액(제2기)에 수산화나트륨액 2방울을 더 넣어 진한 적색으로 하여(제3기 pH 9.1) 시험용액이 이와 같은 색이 될 때까지 0.2 N 수산화나트륨액으로 적정한다. 이상의 조작은 신속하게 하여야 한다.
여기에 소비된 0.2 N 수산화나트륨액의 총 mL수로부터 0.2 N 염산의 mL수 및 대조액의 알칼리소비량(보통 0.1 mL)을 뺀 수치에 2.8배를 하면 홀몰적정 가능한 질소의 양이 얻어진다.
홀몰질소(mg) ＝ 2.8×[VT-(VH＋Ve)]×f
VT：제3기까지의 0.2 N 수산화나트륨액의 총량(mL)
VH：가한 0.2 N 염산용액에 상당하는 0.2 N 수산화나트륨용액의 양(mL)
Ve：대조액에 가한 0.2 N 수산화나트륨액의 총량(mL)
f ：0.2 N 수산화나트륨액의 역가
