2.2.2.13 엽산
 
  
 가. 시험법 적용범위
 
  
 영아용조제식, 성장기용조제식 등에 적용한다.
 
  
 나. 분석원리
 
  
 곡물 및 식품에 함유된 엽산을 10 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 추출하고, 역상 분배형 칼럼을 이용하여 액체크로마토그라프에서 분리하고 UV 280 nm에서 측정한다.
 
  
 다. 장치액체크로마토그래프/자외선흡광검출기(UV photometric detector)
 
  
 라. 시약 및 시액
 
  
 1)10 mM 인산완충용액(pH 8.0)：10 mM 인산수소이나트륨 용액에 10 mM 인산이수소나트륨 용액을 가하여 pH 8.0로 조정하여 제조한다.
 
  
 2) 표준원액 : 엽산 표준품(99.9%)를 0.1 N NaOH 수용액에 녹여 1,000 mg/L이 되도록 조제한다.(4℃이하 암소 보관)
 
  
 3) 표준용액 : 표준원액을 이동상A로 희석하여 10 mg/L로 조제한다.(사용 시 제조)
 
  
 4) 이동상 A : Tetrabutyl ammonium bromide 1.6120g (5 mM)을 pH 7.2로 조정한 인산완충용액을 가하여 1 L가 되게 한 뒤 0.22㎛ 필터로 여과하여 조제한다.
 
  
 5) 검량선표준용액 : 표준용액을 이동상A로 희석하여 정량하기에 적합한 농도로 3개 이상 조제한다.(사용 시 제조)
 
  
 6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 HPLC용
 
  
 마. 시험용액의 조제
 
  
 균질화한 검체(약 2g)를 50 mL 갈색 플라스크에 정확히 칭량하고,10 mM 인산완충용액(pH 8.0)을첨가하여 50 mL로 정용하여 10분간 초음파 추출한 후 원심분리관으로 옮겨 20분간 shaker에서 격렬하게 흔들어 준 다음, 5,000 rpm조건에서 10분간 원심분리를 실시하고, 상등액을 0.22 ㎛의 membrane filter로 여과한 후 시험용액으로 사용한다.
 
  
 바. 시험방법
 
  
 1) 고속액체크로마토그래프의 측정조건
 
  
 가) 칼럼 : Capcellpak C18UG120(4.6 mm×250 mm, 5 ㎛) 및 이와 동등한 것
 
  
 나) 칼럼온도 : 40℃
 
  
 다) 이동상(Isocratic elution)
 
  
 이동상 A: 아세토니트릴을 8:2로 혼합하여 사용한다.
 
  
 라) 이동상 유속 : 1.0 mL/min
 
  
 마) 주입량 : 20 μL
 
  
 바) 검출기파장 : 280 nm
 
  
 2) 검량선 작성
 
  
 검량곡선표준용액을 액체크로마토그래프에 20 uL씩 각각 주입하여 얻어진 크로마토그램 상의 각 피크의 넓이를 구하여 검량선을 작성한다.
 
  
 3) 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램
 
  
 
 
  
 그림 1. 표준용액( 1 ppm)의 크로마토그램
 
  
 
 
  
 그림 2. 시험용액의 크로마토그램
 
  
 
 
  
 그림 3. 액체크로마토그래프 PDA 스펙트럼
 
  
 4) 정량한계 : 1.0 mg/kg
 
  
 사. 정성시험
 
  
 위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.
 
  
 아. 정량시험정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크면적법에 따라 정량한다.
 
  
 1) 계산방법
 
  
 
   
 
    
 
     
 
 엽산 함량(ug/100 kcal) =
 
 
     
 
 Y' ×
 
 
     
 
 V
 
 
     
 
 ×
 
 
     
 
 100
 
 
    
 
    
 
     
 
 S
 
 
     
 
 검체 1 g 당 kcal
 
 
    
 
   
 
  
 
  
 Y' = 검량곡선에 대입하여 얻은 시험용액의 농도(ug/mL)
 
  
 V = 시료 추출에 사용된 용액의 부피(mL)
 
  
 S = 추출시료의 무게(g)