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2.2.2.15 비오틴
가. 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부검출기 또는 액체크로마토그래프/질량분석기에 의한 정량
1) 시험법 적용범위
영아용 조제식, 성장기용 조제식 등에 적용한다.2) 분석원리
식품 중의 비오틴을 추출용매로 추출한 후 면역친화성컬럼으로 정제하여 자외부검출기 또는 질량분석기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.
3) 장치
가) 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부검출기나) 액체크로마토그래프/질량분석기
다) 정제용 컬럼: 비오틴용 면역친화성컬럼(Immunoaffinity column)(회수율 및 재현성 등이 검증된 것)
라) 질소농축기
4) 시약 및 시액
가) 0.01 M 인산이수소칼륨 용액(pH 4.8): 인산이수소칼륨 1.36 g을 증류수에 녹여 1 L로 한다.
나) 표준원액: 비오틴 표준품(99.9%)를 0.01 M 인산이수소칼륨 용액에 녹여 100 mg/L이 되도록 조제한다.(4℃이하 암소 보관)
다) 표준용액: 표준원액을 0.01 M 인산이수소칼륨용액으로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.(사용 시 제조)
라) 0.15 M 인산나트륨 완충액: 제일인산나트륨(NaH2PO4·H2O) 8.07 g과 제이인산나트륨(Na2HPO4·7H2O) 18.36 g을 물에 녹인 것을 2 M 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 7.0으로 조정한 후 1 L로 한다.
마) PBS(Phosphate buffered saline) 용액: 시판되는 PBS 완충제 정제(tablet) 또는 파우치(pouch) 형태를 사용하여 제조한다.(최종 완충액 0.01 M phosphate buffer saline, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4, 25℃)
바) 0.1% 포름산: 포름산을 200 µL를 넣은 후 증류수로 녹여 200 mL로 한다.(질량분석기로 분석시 사용)
사) 0.1% 포름산이 함유된 아세토니트릴: 포름산을 200 µL 넣은 후 아세토니트릴로 녹여 200 mL로 한다.(질량분석기로 분석시 사용)
아) 기타시약: 잔류농약 시험용 또는 HPLC용
5) 시험용액의 조제
가) 추출
균질화한 검체 약 1∼5 g을 달아 갈색원심분리관에 취하고 0.15 M 인산나트륨 완충액 25 mL을 넣고 상온에서 5분간 초음파 추출한 다음 100℃ 수욕 상에서 30분간 추출하고 상온으로 냉각한다. 0.15 M 인산나트륨 완충액을 가하여 50 mL로 정용하고 균질화 후 0℃에서 22,000 ×g으로 20분간 원심분리한다. 이어서 여과지(Whatman No.2 또는 이와 동등한 것)로 여과한 것을 추출액으로 한다.
나) 정제
냉장보관 된 정제용 컬럼은 실온에 30분 방치한 후 컬럼 내부의 완충용액을 완전히 제거한다. 추출액 10 mL를 정제용 컬럼에 주입하여 추출액 중 비오틴을 정제용 컬럼에 흡착시킨다. 이어서 PBS 용액 10 mL와 증류수 10 mL 주입하여 불순물을 제거하고 공기를 주입하여 컬럼 내에 남아 있는 용액을 제거한다. 정제용 컬럼에 흡착된 비오틴을 메탄올 4 mL로 시험관에 용출시킨다. 용출액을 70℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 0.01 M 인산이수소칼륨 용액 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.
6) 시험방법
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
(1) 칼럼
(가) 전처리컬럼: Capcellpak MF C8SG80(4.6 mm × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
(나) 농축컬럼: Capcellpak C18UG120V(2.0 mm × 35 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
(다) 분석컬럼: Capcellpak C18UG120V(1.5 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 전처리컬럼 이동상: 0.01 M 인산이수소칼륨용액
(나) 분석컬럼 이동상: 0.01 M 인산이수소칼륨용액/메탄올(90:10, v/v)
(3) 유속
(가) 전처리컬럼 이동상: 500 μL/min
(나) 분석컬럼 이동상: 100 μL/min
(4) 육방전환밸브의 조작
전처리 칼럼에서 비오틴의 피크 용출시간을 확인하고 농축을 위한 육방전환밸브의 조작시간을 설정한다.
(5) 주입량: 200 μL
(6) 검출기: 자외부검출기(200 nm)
나) 액체크로마토그래프/질량분석기의 조건
(1) 액체크로마토그래프 조건
(가) 컬럼: ACQUITY UPLCⓇBEH(2.1 mm x 100 mm, 1.7 µm) 또는 이와 동등한 것
(나) 이동상
① 이동상 A: 0.1% 포름산
② 이동상 B: 0.1% 포름산이 함유된 아세토니트릴
| 시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
| 0.0 |
100 |
0 |
| 5.0 |
80 |
20 |
| 5.2 |
0 |
100 |
| 6.2 |
0 |
100 |
| 7.0 |
100 |
0 |
| 11.0 |
100 |
0 |
(다) 이동상 유속: 0.2 mL/min
(라) 컬럼온도: 40℃
(마) 주입량: 2 µL
(2) 질량분석기 조건
(가) Ionization: ESI positive
(나) Source temperature: 120 ℃
(다) Collision gas: N2(질소 또는비활성기체)
(라) Capillary voltage: 3.5 kV
(마) 질량분석기 분석을 위한 이온
| 성분 |
Precursor ion(m/z) |
Fragment ion(m/z) |
| 비오틴 |
245 |
227, 166 |
다) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프 또는 액체크로마토그래프/질량분석기에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토마토그램 상의 각 피크 높이 또는 피크 면적을 구하여 검량선을 작성한다.
라) 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램
(1) 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부검출기
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(2) 액체크로마토그래프/질량분석기
7) 정성시험
위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.
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정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크면적법에 따라 정량한다.
가) 계산방법
| 비오틴 함량(µg/100 g) |
= |
C |
× |
(a × V2× b) |
× 100 |
| (S × V1) |
C: 검량곡선에 얻은 시험용액의 농도(μg/mL)
a: 시료 추출에 사용된 용액의 부피(mL)
V1: 정제용 컬럼에 주입한 추출액의 부피(mL)
V2: 정제 후 시험용액의 최종부피(mL)
b: 시험용액의 희석배수
S: 검체 채취량(g)
