- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 5. 원유·식육·식용란의 시험법 ▶ 5.2 식육(이하 “육”이라 한다) 시험법 ▶ 5.2.2 이화학적 시험법
가. 시료의 채취 및 조제법
시료를 골고루 5개 부위에서 총 200 g이상을 채취하며 멸균샤레 혹은 대형 광구병에 넣어 4℃이하에서 동결되지 않도록 보존하여 실험실로 운반한다. 그리고 고기의 종류, 채취장소, 채취일자, 업소명 또는 축주명 등 필요한 사항을 상세히 기재한다. 이렇게 채취한 시료는 균질하게 한 다음 필요한 양을 약절구 등에 취하고 일정량을 평량하여 검사 시료로 한다.
나. 시험방법
1) 일반시험법
가) 수분측정법
시료 2～5 g에 대하여 7. 일반시험법 2.1 일반성분시험법 2.1.1 수분에 따라 시험한다.
나) 회분 정량법
시료 2～5 g을 도가니에 취하고 대부분의 수분을 제거한 다음 알코올 소량을 가하여 점화하여 탄화시키고 전기곤로상에서 더욱 탄화시킨 다음 이하 7. 일반시험법 2.1 일반성분시험법 2.1.2 회분에 따라 시험한다.
다) 지방정량법
시료 5 g에 대하여 7. 일반시험법 2.1 일반성분시험법 2.1.5 지질 2.1.5.1 조지방 2.1.5.1.1 에테르추출법 가. 일반법(속슬렛법)에 준하여 시험한다.
라) 단백질 정량법
시료 1～2 g에 대하여 7. 일반시험법 2.1 일반성분시험법 2.1.3 질소화합물 2.1.3.1 세미마이크로 킬달법에 따라 시험한다.
2) 특수검사법
가) 식육중의 기생충(선모충)검사법
(1) 표준기법
(가) 인공소화를 위하여, 가능하다면, 혀, 늑간 또는 횡격막 근육을 선택한다.
(나) 마쇄기로 검사시료를 마쇄한다.
(다) 37℃에서 수돗물로 조제된 1% 펩신 또는 0.5% 염산용액에 넣고 교반한다. 마쇄재료 10 g에 대하여 용액을 최소한 100 mL를 사용토록 한다. 진단을 위하여는 500 mL을 사용한다.
(라) 자석식 교반기로 계속 교반하든지 또는 빈번한 간격으로 초자봉으로 교반 하면서 37℃에서 4 내지 6시간 동안 항온시킨다.
(마) 0.25 ㎜짜리와 0.075 ㎜ 망체를 통하여 걸러서 수돗물 줄기를 이용하여 잘 세척한다.
(바) 600 mL평량병에 침전법으로 3회 세척해 넣는다. 진단검사를 위한 완전한 침전 재료를 얻기 위하여는 20분간 정치한다.
(사) 따뜻한 물을 넣고 해부 현미경하에서 조심스럽게 검사한다.
(아) 선모충 유충의 감염이 확인된 돼지는 도체 전체를 폐기한다.
(2) 공기응용기법
(가) 검사시료뭉치(25개의 횡격막)내에서 각각의 횡격막에서 10 g씩의 근육을 잘라낸다 (총량 250 g).
(나) 마쇄기에 걸어 25조각을 넣어 마쇄물로 만든다.
(다) 마쇄물 250 g을 정확히 계량하여 3.2 kg짜리 설탕그릇에 넣는다. 4℃에 저장한다.
(라) 검사당일에 마쇄물 250 g을 4리터의 가온 인공소화액(펩신 40 g, 농염산 20 mL 가온상수 37℃ 4리터)에 넣는다.
(마) 공기석과 혼합 교반펌프를 이용하면서 37℃에 항온 처리한다. 펌프는 항온기 상부에 설치한다. 그러나 펌프의 공기주입구는 항온기 내부에 연결하여 37℃의 가온공기가 소화액으로 들어가도록 하여야 한다. 30분후 기류를 체크하고 필요한 경우 펌프를 조정한다.
(바) 소화가 다되면(4～5시간), 설탕그릇의 내용물을 0.25 ㎜짜리 망체와 0.075 ㎜짜리 망체를 통과하도록 붓는다. 차가운 수돗물로 망체를 세척해낸다. 0.25 ㎜짜리 망체와 내용물을 제거한다. 0.075 ㎜짜리 망체의 내용물을 다시 세척한 다음 망체의 한쪽편에 침사를 모으고 400 mL 짜리 비커에 세척해 넣는다.
(사) 이 침사와 세척액을 20분간 정치시킨 다음, 잔사와 상층 혼합액 10내지, 20 mL를 남기고 상층액을 따라 버린다. 잘 섞은 후 페트리디쉬에 담는다.
(아) 10x의 접안렌즈와 1.25x의 대물렌즈를 이용하여 의심스런 유충을 검사한다. 검사될 용액은 소량이므로 페트리디쉬의 전체가 다 검사되도록 주의깊게 검사한다.
나) 식육감별법
(1) Glycogen검사법
시료 50g을 잘게 썰어 잘 분쇄한 다음 200 mL의 증류수를 가하여 1시간 동안 끓인 다음 냉각하고 여과한다. 이 여과액 5～10 mL를 시험관에 넣고 요오드 틴크액을 첨가할 때 접촉면에 암적색 내지 적갈색의 테가 생기면 Glycogen 양성이다.
그러나 단순한 암색이나 혼탁을 나타내면 다시 아래의 방법에 따라 시험한다. 시료 50 g에 KOH(1.5 : 30)용액 200 mL를 가하고 가열하여 근육조직을 충분히 파괴시킨후 여과하고 이 여과액을 증발농축시켜 약 50 mL가 되게 한 다음 냉각시키고 석출된 단백질을 다시 여과한다. 만약 이 여과액이 착색되어 있을 때는 10% HNO3액을 소량씩 적하하여 탈색시키고 이 액에 대하여 상기의 요오드반응 시험을 실시한다.
<각종 육류중의 Glycogen 함량>
| 육종 성분 |
마육 |
우육 |
송아지육 |
돈육 |
| 수 분(%) Glycogen(%) Glucose (%) |
73.9 0.675 0.225 |
75.3 0～0.164 0.036～0.196 |
78.8 0 0.21～0.25 |
73.8 0 0.100～0.208 |
(참고자료)
(2) 지방검사법
시료를 잘게 썰어 잘 분쇄한 다음 증류수를 가하여 약 30분간 끓인 후 상층에 유리된 지방을 취한다. 이 지방을 분액 깔대기에 옮기고에테르을 가하여 잘 진탕하고 정치시켜 수분을 분리한 다음에테르을 증발시켜 순수한 지방을 얻는다. 이 지방을 한쪽 끝이 막힌 유리모세관에 넣고 지방이 굳어지기를 기다렸다가 다시 수은 1적을 그 위에 놓고 온도계가 부착된 수조 중에서 약하게 가열하여 지방의 용융점을 구한다.
<각 가축의 지방용융점>
| 가축의 종류 |
지방용융점 |
가축의 종류 |
지방용융점 |
| 소 말 |
45～50℃ 45～54℃ |
양 돼지 |
43～55℃ 43～48℃ |
위의 수치는 실험자, 기타 실험설비 등에 따라 차이가 있으므로 각기 지방 용융점을 구한 다음 그 성적에 준하여 판별하여야 한다.
(3) 자비법
깨끗한 냄비에 시료 한조각을 넣고 증류수를 가하여 뚜껑을 덮은 채 끓이고 끓기 시작하면 뚜껑을 열어 검사시료 중에서 발산되는 수증기의 냄새를 순간적으로 맡아 각 식육의 특유한 냄새를 관능적으로 판별한다.
(4) 혈청학적 검사법
(가) 면역혈청의 조제
① 면역용 항원
칼륨명반으로 처리한 자비혈청, 또는 농축생육 침출액의 생리적 식염수 부유액이 농후하여 주사하기 어려울 때에는 근육내 주사하는 것을 고려하여 적당량의 생리적 식염수를 추가한다.
② 면역혈청의 조제
혈청을 입수가능한 동물종(소, 말, 돼지, 면양, 산양, 개, 고양이등)에 자비혈청 (30분), 혈청의 입수가 곤란한 동물종(고래, 캥거루 등)에는, 생육으로 부터의 침출액으로 토끼를 사용하여 면역혈청을 조제한다. 혈청을 사용하는 경우: 적어도 2～3마리의 혈청을 채취한다. 혈청을 물 (1:3)로 희석하여 30분간 끓인다. 냉각시킨 후 100 mL에 대해서 10% 명반용액(여과 멸균한 것, 가열해서는 아니됨) 5～10 mL를 가한다. 생성된 백탁을 원심분리하여 잔사를 약절구로 마쇄하여 생리적 식염수로 부유시킨다. 이때 액량은 혈청을 희석하기전의 양으로 되돌린다. 여기에서 얻은 항원과 체중 3 kg정도의 토끼에 7일 간격으로 4회, 1회 2 mL를 후지근육 내에 주사한다. 최종 주사 후 7～10일째에 시험채혈을 한다. 항원희석법으로 3,200배 이상 양성인 것을 전채혈한다. 만약 항체의 상승이 인정되지 않을 경우에는 다시 일주일 후에 채혈하여 검사한다든가 또는 추가면역을 실시한다.
전채혈에서 얻은 면역혈청은 50℃에서 30분간 처리하여 비동화시킨 후 마죠닌을 1:5000의 비율로 가하여 빙실 또는 냉장고에 보존한다.
면역혈청을 소분하여 두면 사용 시 편리하다.
얻은 면역혈청의 종특이성(種特異性)에 대해서는 침강반응의 술식항에 따라 유속 (類屬)반응을 나타내는 가를 확인한다.
생육침출액의 경우 : 적어도 2～3마리의 고기를 만육케 한다.
만육 1에 생리적 식염수 2의 비율로 가하여 잘 진탕 혼화 시킨후 하룻밤 냉장한다. 침출액은(필요에 따라 짜서) 채취하여 pH 7.0으로 조정한다. 10,000 rpm에서 원심분리 하여 상층액을 채취한다. 이때 표면에 지방이 떠오르므로 여지로 여과하여 지방을 제거한다. 셀로판막을 사용하여 고형 폴리에칠렌 글리코올을 써서 침출액을 약 1/10로 농축시킨다.
농축액을 혈청의 경우와 같이 10% 명반액으로 처리하여 원심분리하여 모으고 잔사를 약절구로 마쇄하여 생리적 식염수로 부유시킨다. 이때의 액량은 농축침출액의 양과 일치시킨다. 3 kg 전후의 토끼의 후지근육에 7일 간격으로 4회, 1회 1 mL를 주사한다. 최종 주사후 7～10일째에 시험채혈을 하여 3,200배 이상 양성의 것을 전채혈한다. 이하 혈청으로 면역하는 경우에 준하여 실시한다.
③ 면역혈청의 보존
얻어진 면역혈청은 비동화후 질화나트륨(1:1,000～10,000)을 가하여 소분하여 동결(-20℃)보존한다.
④ 면역혈청의 흡수
얻어진 면역혈청이 이종동물의 생육침출항원과 교차 반응을 나타날 때는 해당 동물의 비동화 혈청을 가하여 4℃에서 24시간 방치후 석출된 침전을 3000 rpm 에서 15분간 원심하여 제거하고 그의 상청을 흡수혈청으로 한다. 흡수할 때에는, 한번에 다량의 혈청을 가하여 흡수조작을 피하여 소량씩 수회로 나누어 실시한다. 이종동물의 생육침출액에 대해서 반응이 없어질 때까지 반복하여, 1회의 흡수조작에 가하는 혈청의 양은, 면역혈청 10 mL당 0.1～0.2 mL로 한다.
(나) 시료(생육)로부터의 침강반응용 항원의 조제 : 면역용 생육침출액의 조제에 따르든가 (이 경우에는 반드시 농축치 않아도 된다) 또는 아래의 방법으로 실시한다.
시료 10 g에 생리적 식염수 40 mL를 가하여, 호모게나이자로 2분간 균질화한다. 37℃에서 60분간, 가열침출한 후 여지로 여과한다. 중층법에 따라 실시할 경우에는 여액의 pH를 7.0으로 조정한 후 원심상층(10,000 rpm에서 15분간)을 항원으로 한다. 이때 투명한 액이어야 한다. 겔 확산법의 경우는 여액을 그대로 항원으로 한다.
(다) 면역반응의 술식
① 면역혈청침강반응(중층법)
침강반응용 시험관(내경 2～3 ㎜, 높이 75 ㎜) 및 미량 피펫을 준비한다. 이것은 미리 멸균하여 둘 필요가 있다. 농축시킨 육의 엑기스를 50에서 12,000배까지 희석한다. 필요에 따라서는 고농도 혹은 저농도에 대해서 실시한다. 먼저 미량피펫으로 소량의 면역혈청을 침강반응용 시험관에 분주한다.
그위에 다른 미량피펫으로 소량의 항원을 조용히 중층하여 접촉면을 만든다.
37℃의 부란기에 넣어 30분인 1시간 후에 검사한다.
결과의 판정: 다음을 표준으로 하여 성적을 기록한다.
+++ : 침강물의 양이 상당히 많으며 두터운 원판을 만들고 또한 그의 일부가 관저에 침전되어 있는 것
++ : 비교적 두터운 원판을 보이는 것
+ : 엷은 원판을 나타낸 것
± : 침강물의 형성이 매우 적어서 다소 상층의 액에 혼탁하게 보이며 대조와는 뚜렷한 차이가 있는 것
: 침강물이 없어, 대조와 차이가 없는 것
침강반응양성(+, ++, +++)인 것에 대해서는 육종(肉種)을 밝힐 수 있게 된다.
② 미량겔 확산법(신속법)
㉮ 검사재료
육엑기스 표준항온 : 생육의 경우에는 육종기지의 만육(挽肉)을 4배량의 생리적식염수중에 현탁시켜 37℃에서 1시간 유지시킨 다음 여과한다. 여액을 동결건조하여 사용할 때까지 -20℃에 보존한다. 가열육의 경우에는 육종기지의 식육을 100℃에서 30분간 끓인 후, 2배량의 0.2 N 수산화나트륨을 첨가하여 37℃에서 1시간 유지한다. 0.2 N 염산을 첨가하여 pH를 6.0으로 조정한 다음, 생리적 식염수를 첨가하여 최종농도를 20(w/v)%로 조정한다. 4℃에서 18시간 유지한 후 여과하여 여액을 -20℃에서 사용할 때까지 보관한다.
면역항혈청의 조제 : 면역혈청 침강반응항의 조제법에 따른다.
㉯ 조작술식 : 현미경용 스라이드글라스(28×76 ㎜) 위에 1% 한천 3.3 mL를 흘리고 냉각시킨 후 직경 2.0 ㎜의 중심공(中心孔)과 같은 직경의 주변공 (周邊孔)을 3.0 ㎜의 거리로 첨공하여 약 0.05 mL의 항혈청 및 각종 육엑기스 표준항온을 각각의 중심공 및 주변공에 유입한다. 실온에서 습한 상태로 4～6시간 방치시킨 후에 침강곡선을 관찰하여 육종을 판정한다.
이상의 미량겔확산법에 의한 경우, 아래사항에 유의하여 실시하여야 한다. 한천은 pH 8.0의 바비튤 완충액에 분말한천(혈청반응용)을 1%의 비율로 가하여 가열 용해한 것을 사용한다. 판정은 실온(20℃)에서 18～24시간 방치한 다음 실시한다. 이 기간동안 한천이 건조되지 않게 적당한 습기를 유지하는 용기에 보관하여야 한다.
③ 한천겔 확산법
한천겔 평판의 작성은 아래와 같이 실시한다.
생리적식염수 95 mL에, 분말한천(혈청반응용) 1.0～1.5 g, 붕산완충액(pH8.5) 5 mL 및 질화나트륨 10 ㎎을 가하여 가열, 용해한다.
한천액을 샤레에 옮기고 두께 3 ㎜의 한천평판으로 한다. 다음 그림과 같은 겔 천공기를 사용하여 직경 6 ㎜의 구멍을 원의 중심 및 원주위에 뚠다.
각각의 구멍의 중심에서 중심까지의 간격은 9 ㎜로 한다.
천공기로 사용치 않을 경우에는 미리 구멍의 배치도를 그린 종이를 샤레 밑에 놓고 적당한 기구로 한천의 구멍을 뚠다.
중심의 구멍에 면역혈청, 주위의 구멍에 검사육 침출액을 각각 약 50 μL씩 모세관 피펫으로 주입한다.
판정은 수분의 증발을 방지하면서 실온(25℃전후)에서 24～36시간 방치한 다음 면역혈청공과 항온공간에 생기는 침강대의 유무에 의한다.
어떠한 술식에 의할 경우라도, 반드시 기지동물종의 생육침출액을 양성대조로, 생리적식염수 혹은 사용한 완충액을 음성대조로 두어야 한다. 또한 겔확산법에 의할 경우에는 동일한 스라이드글라스 혹은 평판상에 2종 이상의 면역혈청을 취급하여서는 안된다.
④ 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
시중에 통상적으로 판매되는 식육종감별용 ELISA 키트 (meat species identification test kit)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 실험 후 판정한다(다만 돈육, 우육, 가금육, 면양육에 한한다).
(5) 히스티딘 디펩타이드(Histidine dipeptide)함량 측정법
(가) 시약 및 시액
① 이동상 A : 물 약 700 mL에 lithium citrate 9 g과 lithium chloride 20 g을 넣어 녹인 후 pH를 7.5로 맞춘 다음 1 L로 한다.
② 이동상 B : 물 약 700 mL에 lithium hydroxide 6 g과 lithium chloride 6 g을 넣어 녹인 후 pH를 14로 맞춘 다음 1 L로 한다.
③ 유도체화용액 : o-프탈알데히드 100 ㎎을 메탄올 10 mL에 녹여 OPA diluent (Pickering Lab.) 950 mL에 넣은 후 Thiofluor 2 g 및 Brij 35용액 3 mL를 순차적으로 가한다.
④ 표준용액 : L-anserine 및 L-carnosine을 각각 증류수에 녹여 50 μM이 되게 한다.
⑤ 0.9% 염화나트륨 용액 : 물 약 10 mL에 염화나트륨 0.9 g을 넣어 녹인 후 물로 100 mL로 한다.
⑥ 8% sulphosalicylic acid 용액 : 물 약 30 mL에 sulphosalicylic acid 8 g을 넣어 녹인 후 물로 100 mL로 한다.
(나) 시험용액의 조제
시료 약 1 g에 0.9% 나트륨염용액 1 mL를 가하여 마쇄기로 혼합한 후, 다시 8% sulphosalicylic acid 용액 4 mL를 첨가하여 충분히 균질화한 다음 20℃에서 30분간 초음파처리한다. 균질화된 혼액을 12,000 rpm에서 30분간 원심분리한 다음 상층액을 0.45 ㎛의 여지로 여과하여 시험용액으로 한다.
(다) 시험방법
① 고속액체크로마토그래피의 조건
- 칼럼 : Lithium cation exchange column(안지름 3 ㎜, 길이 150 ㎜)
- 칼럼온도 : 42℃
- 검출기 : 형광검출기(여기파장 330 ㎚, 형광파장 466 ㎚)
- 이동상
| 시간(분) |
이동상 A |
이동상 B |
| 0 5 130 |
100 100 94 |
0 0 6 |
- 유속 : 0.3 mL/분
- 반응조 온도 : 130℃
- 형광반응조 : 이동상에 대해 유도체화용액(형광액)을 넣고 일정하게 유지 한다.
② 정량시험
시험용액 및 표준용액을 각각 20 μL씩 주입하여 얻은 표준용액의 피크면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액중의 히스티딘 디펩타이드 함량을 구하고 그 비를 산출한다. 이 시험법은 소, 돼지, 말, 닭, 오리 및 칠면조의 식육을 감별할 수 있을뿐만 아니라 열처리육에서도 감별이 가능하다.
(예)
| 축 종 |
Carnosine/ Anserine ratio |
축 종 |
Carnosine/ Anserine ratio |
| 소 돼지 말 |
8.33±1.87※ 30.07±12.66 134.58±39.77 |
닭 오리 칠면조 |
0.39±0.20 1.61±0.58 0.07±0.02 |
※ 평균±표준편차
(6) 유전자혼성화(DNA-hybridization)법
(가) 시약 및 시액
① 추출용액 A : 100 mM NaCl/5 mM EDTA/100 mM Tris-HCl/1% lauryl sulfate (SDS)/10 mM dithiotreitol(DTT)
② 페놀용액 : 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25 : 24 : 1)
③ 추출용액 B : 100 mM NaCl/5 mM EDTA/100 mM Tris-HCl/1% lauryl sulfate (SDS)
④ dNTP labeling mixture(pH 7.5) : 1 mM dCTP/1 mM dGTP/1 mM dATP/0.65 mM dTTP/0.35 mM DIG-dUTP
⑤ 혼성화반응용액(hybridization buffer) : 0.1% N-laurylsarcosine/ 0.02% SDS/5×SSC buffer(saline-sodium citrate buffer)/1% blocking solution
⑥ 세척액Ⅰ: 2×SSC/0.1% SDS
⑦ 세척액Ⅱ(소, 염소, 면양) : 0.1×SSC/0.1% SDS
⑧ 세척액Ⅱ(돼지, 말, 개) : 0.4×SSC/0.1% SDS
⑨ 세척액Ⅱ(닭, 칠면조, 오리) : 2×SSC/0.1% SDS
(나) 시험방법
① 식육에서의 DNA 분리
식육을 잘게 마쇄하여 일정량을 취한 다음 검사시료량의 20배 용량에 해당하는 추출용액 A를 가하고 혼화하여 60℃에서 1시간 정치한다. 여기에 추출용액A와 동량의 페놀용액을 첨가하고 원심분리(12,000 rpm, 10분)하여 상층액을 분리한다. 분리된 상층액에 상층액의 2배 용량에 해당하는 에탄올을 가하고, 3 M sodium acetate를 넣은 후 -70℃에서 10분간 정치한다. 다시 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전된 DNA를 회수하여 Tris-EDTA buffer(TE-buffer)에 용해한다.
② Probe 작성
분쇄한 간 조직 일정량을 취하고 취한량의 20배 용량의 추출용액B를 첨가하여 1시간 정치시킨 다음 페놀용액으로 3회 추출한다. 이를 원심분리하여 추출액의 상층액을 분리한 후 위의 ① 식육에서의 DNA 분리의 ‘분리된 상층액의 2배 용량에 해당하는～ ’ 이하의 과정과 동일한 방법으로 DNA를 회수한다. 여기에 ribonuclease-IA(1000 ㎍/mL)를 가하고 37℃에서 1시간 반응시켜 RNA를 제거한다. 다시 페놀용액 추출과 에탄올 침전을 반복하여 DNA를 정제하고 정제된 DNA는 초음파처리기로 단편화한 후 probe용 DNA로 사용한다. Probe의 표지는 단편화된 probe용 DNA를 끓는 물에 10분간 침지하고 즉시 얼음에 담구어 완전히 냉각시킨 다음 DNA 3 ㎍에 hexa- nucleotide mixture 2 μL, dNTP labeling mixture 2 μL 및 Klenow enzyme(2 unit/μL) 1 μL를 가하여 37℃에서 24시간 반응시킨다. 표지가 완료된 후 0.2 M EDTA(pH 8.0) 2 μL를 가하여 반응을 중지시킨 후 다시 에탄올로 침전시켜 DNA를 회수하여 probe로 사용한다.
③ 혼성화반응(Hybridization)
식육에서 분리한 DNA를 nylon membrane에 옮겨 UV- illuminater상에서 5분간 crosslinking한 다음 이 membrane에 혼성화반응용액을 가하여 68℃에서 약 1시간 평형화한다. 다시 membrane을 probe가 첨가된 혼성화반응 용액에 침지시켜 68℃에서 12시간 혼성화 한다. 혼성화가 완료되면 membrane을 실온에서 세척액Ⅰ로 5분간 2회 세척한 다음 축종에 따라서 세척액Ⅱ를 차등 적용하여 세척한다. 세척 후 membrane은 anti-digoxigenin-alkaline phosphotase conjugate와 실온에서 30분간 반응시키고 NBT(Nitroblue tetrazolium)와 X- phosphate용액을 기질로 암실에서 발색하여(아래의 축종별 혼성화반응조건 참조) 관찰한다.
<축종별 혼성화반응조건 >
| 구 분 |
소, 염소, 면양 |
돼지, 말, 개 |
닭, 오리, 칠면조 |
| probe농도(ng/mL) |
200 |
200 |
200 |
| 혼성화반응 |
12시간, 68℃ |
12시간, 68℃ |
12시간, 68℃ |
| 세척액Ⅱ (세척조건) |
0.1×SSC/0.1%SDS (65℃, 15분, 2회) |
0.4×SSC/0.1% SDS (65℃, 15분, 2회) |
2×SSC/0.1% SDS (65℃, 10분, 2회) |
| 발색시간(분) |
30 |
20 |
40 |
(다) 결과판독
① 알고있는 축종의 식육을 대조군으로 하여 상기의 시험과 같은 조건으로 실시하여 검사시료의 발색환(청보라색)과 색의 강도를 비교하여 감별한다.
(예) 축종별 식육중 닭고기의 감별
<주 해>
축종별 식육에서 추출한 DNA 즉 쇠고기(B), 돼지고기(P), 말고기(H), 오리고기(D), 칠면조고기(T), 면양고기(S), 개고기(N) 및 염소고기(G)의 DNA는 membrane의 아랫줄에 dotting(각 1000 ng), 닭고기의 DNA는 윗줄에 농도별로 dotting(C1: 1000 ng, C2: 500 ng, C3: 250 ng, C4: 125 ng)한 다음 닭 probe로 혼성화한 그림이다.
닭고기의 경우(식육추출DNA와 probe가 동일 축종인 경우) 명확한 발색환을 형성하며 그 강도는 DNA농도에 비례한다.
닭과 근연관계인 오리고기(D), 칠면조고기(T)에서도 발색환이 관찰되나 그 강도는 동일 농도조건에서 닭고기(C1)의 발색환에 비하여 미약함. 따라서 발색강도 차이에 따라 근연관계 축종의 식육도 감별 가능하다.
이 시험법은 소, 돼지, 닭, 말, 오리, 칠면조, 면양, 개 및 염소 등 근연축종을 포함한 9종의 식육을 감별할 수 있을 뿐만 아니라 열처리육에서도 적용이 가능하다.
다) 부패육 검사법(신선도 검사법)
(1) 부패육(신선도) 판정기준
| 시 험 항 목 |
기 준 |
| ◦ pH ◦ 휘발성염기질소 |
6.2～6.3이면 부패초기로 의심 시료 100 g중 20 ㎎이하 |
(2) 암모니아 시험법
25% 염산,에테르, 알코올 혼합액(1:1:3)을 직경 2 ㎝ 높이 10 ㎝의 관저로부터 1 ㎝ 높이 되게 넣어 마개를 하고 밀봉한 후 잘 진탕하여 끓는 물속에서 가열한다. 다음 검사시료의 소편을 백금선에 붙여서 신속히 마개를 열고 관벽에 육편이 닿지 않게 그리고 시약면에서 약 1 ㎝ 높이 되게 육편을 달고 관찰할 때 흰 안개가 관내에 발생하면 양성으로 판정한다.
이때 신선한 동일종의 육을 대조로 하여 시험하면 보다 정확한 판정을 할 수 있다.
(3) 유화수소 검출법
시료 10～25 g을 잘게 썰어 시험관에 넣고 시료가 완전히 젖을 정도의 묽은 황산액을 가하고 10% 질산연(Lead nitrate) 또는 초산연(Lead acetate) 용액을 시료가 완전히 잠길 정도로 추가한다.
다음 여과지를 액면이나 시험관의 벽에 접촉되지 않게 매달은 후 밀봉하고 관찰할 때 지편이 담황색 내지 갈색을 나타내면 소량의 유화수소가 존재함을 의미하며 담홍색으로 변하면 다량 존재하는 것으로 판정한다.
(4) 휘발성염기질소의 측정법(Conway법)
6. 식품별 규격 확인 시험법, 6.9 식육 및 알가공품 6.9.4 식육 또는 알함유가공품 6.9.4.1 휘발성 염기질소에 따라 시험한다.
(5) pH측정법
시료 5 g을 잘 마쇄하여 물 20 mL를 가하고 침출시킨 다음 원심분리하여 상층액을 pH메타로 측정한다.
이때 신선한 동일종의 육에 대해서 대조로 시험하여 비교함이 바람직하다.
이상의 여러 시험을 하여 동시에 실시하여 판정함이 타당하다.
(6) Walkiewicz반응
(가) 시료 : 5 g을 비커에 취하고 물 50 mL를 가하여 침출(30분) 후 여과
(나) 별도로 시험관A에 A액(1% HgCl2) 2 mL, 시험관B에 B액(1% HgCl
2를 0.05%되게 초산으로 희석한 것) 2 mL를 취하여
(다) 여액 0.1 mL씩을 적가
(라) 다음 표에 따라 판정
| 부패의 정도(선도) |
A 액 |
B 액 |
| 초기부패의 직전 |
+ |
+ |
| 초 기 부 패 |
+ |
± |
| 부 패 |
++ |
+～++ |
- : 전혀 혼탁되지 않은것
± : 원액 0.1mL를 가할때 약간 혼탁하나 시험관을 흔들면 다시 투명하게 되는 것.
+ : 혼탁되며 시험관을 흔들어도 전체가 혼탁한 것
++ : 혼탁이 침전되어 가라 앉는 것
(7) Trimethylamine 시험
(가) 시료 10～20 g을 비커(100 mL용)에 취하고 물 50 mL를 추가한 다음 30분간 교반침출
(나) 제단백(20% TCA 10～20 mL)
(다) 물을 가하여 100mL로 하여 여과(1 mL까지)
(라) 여액 5 mL( Trimethylamine으로 2～20 ㎍)를 25 mL용 분액깔대기에 취함.
(마) 중성포르말린(1 : 3) 1 mL, 톨루엔 10 mL, 포화탄산칼슘액 3 mL를 가하고 1분간 진탕, 5분간방치
(바) 상층(톨루엔)을 무수황산나트륨(약 0.5 g)이 함유된 공전시험관에 옮겨서 탈수(탈수 톨루엔 용액)
(사) 0.02% 피크린산의 건조톨루엔 용액 5 mL를 가한 다른 공전시험관에 (바)의 탈수 톨루엔액 5 mL를 주입.
(아) 생성된 황색도를 표준액과 비교(파장 420 ㎚)
☆ 표준액 : Trimethylamine을 위와 같이 처리하여 발색시킨다.
☆☆시료 100 g중 4～6 ㎎이면 부패초기로 인정
