- ▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 6. 식품별 규격 확인 시험법 ▶ 6.4 음료류 ▶ 6.4.2 인삼·홍삼음료 ▶ 6.4.2.1 인삼·홍삼성분
6.4.2.1 인삼·홍삼성분(진세노사이드 Rb1, Rg1, Rg3로서)
가. 박층크로마토그래프 분석법
1) 분석원리
에탄올 및 에테르를 이용하여 시료로부터 진세노사이드 성분을 추출한 후 박층크로마토그래프를 이용하여 정성분석하는 방법이다.
2) 시약 및 시액
가) 물포화 부탄올 : n-부탄올과 증류수를 70:30의 비율로 혼합한 후 충분히 진탕하고 정치하여 물포화 부탄올층과 물층을 완전히 분리시킨다. 완전히 분리된 상층의 물포화 부탄올층을 따로 모아 사용한다.
3) 표준용액 조제
진세노사이드 표준물질(인삼음료는 Rb1과 Rg1을 사용하고, 홍삼음료는 Rb1, Rg1 및 Rg3(S)를 사용한다)을 각각 50 mg씩 50 mL 부피플라스크에 칭량한 후 메탄올로 정용하여 표준원액을 조제하고(1 mg/mL), 표준원액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액을 만든다.
4) 시험용액 조제
검체 약 10 ∼ 50 g을 달아 250 mL의 둥근바닥플라스크에 넣고, 70%의 에탄올 100 mL를 가하여 환류냉각기를 붙여 100℃에서 90분간 가열추출한 다음 여과하여 감압 농축한다.
농축액을 물 20 mL에 녹여서 에테르 20 mL씩 3회 반복 추출하여 불순물을 제거하고, 물층을 취해 물포화 부탄올 20 mL씩 3회 반복 추출한다. 물포화 부탄올층을 합하여 감압농축한 다음, 소량의 메탄올에 녹여 시험용액으로 한다.
5) 시험
시험용액 및 표준용액을 미리 110℃에서 15분간 건조하고 실온에서 30분간 식힌 실리카겔판에 찍어 전개용매로 전개한 후, 10% 황산용액 또는 50% 황산에탄올용액을 분무하여 110℃에서 10분간 가열하여 발색시키거나, 전개시킨 다음 실리카겔판을 110℃에서 건조하여 포화요오드 발색조에 넣어 발색시켜 나타난 색과 위치를 육안 또는 자외선(약 365 nm)에서 표준용액과 비교 확인한다.
6) 전개용매
가) 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 65 : 35 : 10, 하층액 사용
나) 1 – 부탄올 : 초산 : 물 = 4 : 1 : 5, 상층액 사용
다) 1 – 부탄올 : 에틸아세테이트 : 물 = 5 : 1 : 4, 상층액 사용
나. 액체크로마토그래프에 의한 시험
1) 분석원리
증류수 및 유기용매를 이용하여 시료로부터 진세노사이드 성분을 추출한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 또는 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 이용하여 정성 분석하는 방법이다.
2) 장치 및 기구
가) 정제용 카트리지 : C18 카트리지 (6 cc, 500 mg) 또는 이와 동등한 것
나) 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 또는 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 사용한다.
3) 시약 및 시액
가) 이동상 : A-물, B-아세토니트릴
나) 메탄올
다) 표준용액 :진세노사이드 표준물질(인삼음료는 Rb1과 Rg1을 사용하고, 홍삼음료는 Rb1,Rg1 및 Rg3(S)를 사용한다)을 각각 50 mg씩 50 mL 부피플라스크에 칭량한후 70% 메탄올로 정용하여 표준원액을 조제하고(1 mg/mL), 표준원액을 70%메탄올로 적절히 희석하여 표준용액을 만든다.
4) 시험용액의 조제
가)검체 5 mL를 취한 후 20 mL가 되도록 물로 희석하고(필요시 농축 또는 희석) 1,600 x g에서 5분간 원심분리한다.
나) 카트리지에 메탄올 5 mL와 증류수 10 mL를 연속으로 통과시켜 활성화시킨 후 가)의 상등액 5 mL를 흡착시킨다.
다) 나)의 카트리지에 25 mL의 증류수와 25% 메탄올 10 mL로 세척(분당 2∼3 mL)한 후 메탄올 4 mL로 용출한다.
라) 용출액은 5 mL 부피플라스크에 모으고 메탄올로 표선까지 정용한 것을 시험용액으로 하고 필요시 적절히 희석한다.
5) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
(1) 검출기 : 자외부흡광광도검출기, 203 nm
(2) 칼럼：옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전 입자크기 5 µm,충전제 octadecylsilica) 또는 이와 동등한 것
| 시간(분) |
이동상(%) |
|
| A 용액 |
B 용액 |
|
| 0 |
80 |
20 |
| 5 |
80 |
20 |
| 20 |
77 |
23 |
| 25 |
70 |
30 |
| 45 |
60 |
40 |
| 55 |
50 |
50 |
| 65 |
50 |
50 |
| 70 |
80 |
20 |
| 75 |
80 |
20 |
(4) 칼럼온도 : 30°C
(5) 유속：1 mL/min
(6) 주입량 : 10 μL
나) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기의 측정조건
(1) 검출기 : 질량분석기
(2) 칼럼 : 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전 입자크기 1.7 µm, 충전제 octadecylsilica) 또는 이와 동등한 것
(3) 이동상
| 시간(분) |
이동상(%) |
|
| A 용액 |
B 용액 |
|
| 0 |
80 |
20 |
| 0.1 |
80 |
20 |
| 12 |
20 |
80 |
| 13 |
0 |
100 |
| 13.1 |
80 |
20 |
| 15 |
80 |
20 |
(4) 칼럼온도 : 40°C
(5) 유속：0.3 mL/min
(6) 주입량 : 1 μL
(7) 이온화 : ESI, negative
(8) 검출이온
Rb1 : 1,107(precursor ion), 179(product ion)
Rg1 : 799(precursor ion), 637(product ion)
Rg3 : 783(precursor ion), 621(product ion)
6) 정성시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 크로마토그램상의 진세노사이드 Rg1과 Rb1, Rg3의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액과 시험용액의 머무름 시간이 일치하여야 한다. 또는, 질량분석기로 분석하였을 때 머무름 시간이 일치하여야 하며, 시험용액 중 표준물질의 m/z의 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z값과 일치하여야 한다.
